원발성 및 재발성 난소암 환자의 복수 내 림프구 체외증폭 시 CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) 조절 T 림프구 분포의 비교 = Comparison of proportion of CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) regulatory T lymphocyte in ex vivo expansion in ascitic fluid from patients with primary and recurrent ovarian carcinoma

국문 초록 (Abstract)

목적: 암세포는 세포성장을 조절하는 기전의 파괴로 인하여 발생하며 적절한 면역반응의 실패로 암세포가 제거되지 못할 때 과도한 증식을 하게 된다. 암세포의 생성과 억제에 관여하는 인체의 면역반응에는 항종양 효과를 나타내는 체액성 항체, 자연 살해 세포 (natural killer cell, NK cell), 활성화된 거대세포, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte), 수지상 세포(dendritic cell) 등이 있으며, 다양한 작용으로 암세포들에 대한 면역반응을 일으키고 있다. 이때 암세포에 대한 면역반응을 주도하는 세포매개성 면역체계가 억제되고, 체액성 면역체계가 활성화되는 불균형 상태가 발생하면서 암세포가 활성화된다. 최근 조절 T 림프구(regulatory T lymphocyte)는 암세포에 대한 면역관용(immune tolerance)을 일으켜 특정 항원에 대한 T 림프구의 작용을 감소 또는 상실시킴으로써 암세포의 빠른 성장, 국소 침입과 혈행성 전이에 관여하는 것으로 발표되었다. 많은 연구들은 난소암 환자의 복수에서 채취한 TAL(tumor associated lymphocytes)과 암 조직 자체에서 획득한 TIL(tumor infiltrating lymphocytes)을 IL-2(interleukin-2)를 이용하여 증폭시킴으로써 입양면역치료(adoptive immunotherapy)를 위한 T 림프구를 개발하여왔다. 그러나 아직까지 IL-2를 이용한 체외 증폭이 조절 T 림프구의 증식과 면역 억제 기전에 어떠한 변화를 일으키는지 명확히 밝혀진 바가 없다. 이 연구의 목적은 난소암 환자의 복수 내 림프구를 체외증폭 하였을 경우, 조절 T 림프구의 분포의 변화를 파악하고, 이러한 변화가 원발성 환자들과 재발성 환자들에서 어떠한 차이를 보이는지를 확인함으로써 향후 입양면역치료의 발전을 위한 정보를 제공하는 것이다.
대상 및 방법: 2005년 1월부터 2006년 8월까지 서울아산병원에 입원하였던 19명의 치료를 시행 받지 않은 진단 초기의 원발성 난소암 환자와 7명의 일차치료 후 재발한 난소암 환자들의 복수에서 Ficoll-Hypaque 밀도 기울기 원심 분리법으로 림프구를 분리한 후 항CD3 항체, 항 CD4 항체, 항 CD8 항체, 항 CD16/56 항체, 항 CD25 항체, 항 FoxP3 항체로 flow cytometry를 이용하여 세포 표식자 분석을 시행하였다. 또한 분리된 림프구는 IL-2를 이용하여 체외증폭을 시행하고 배양 2~3주 사이에 같은 방법으로 세포 표식자 분석을 시행하였다.
결과: 복수내의 림프구 체외증폭 결과 진단 초기의 환자들보다 재발한 환자들에서 세포의 증가 폭이 유의하게 더 컸다(p <0.05). 각 림프구의 분포를 살펴보면, CD4^(+) T 림프구가 증가하고(p <0.05), CD8^(+) T 림프구는 감소하였으며 (p <0.05), CD3^(-)CD16^(+)56^(+) NK cell의 경우 유의한 차이는 없었다. 그리고 이러한 양상이 재발한 환자들의 경우에서 더욱 두드러지기는 하였으나 통계적 유의성은 없었다(p =0.254). 한편, CD4^(+) T 림프구 내에서 CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) 조절 T 림프구가 차지하는 비율이 체외배양 후 유의하게 증가하였으며 (p <0.05), 재발한 환자들의 경우에서 증가 폭이 더 컸다(p <0.05).
결론: 이상의 결과로 난소암 환자에서, 특히 재발한 환자들의 경우 입양면역치료를 위해 림프구 체외증폭을 시도할 때 림프구의 증식은 더 많이 이루어질 수 있으나 세포독성 림프구나 NK cell 보다 오히려 면역억제를 일으키는 조절 T 림프구의 증식이 활발할 것이라는 사실을 추정할 수 있다. 이 같은 결과는 현재 시도되고 있는 난소암 환자에서의 항암면역치료에 기초적인 자료로 이용될 수 있다고 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objectives: The emergence of a tumor results from the disruption of cell growth regulation as well as from the failure to provoke a sufficient immunological response to tumor cells. The immune response associated with growth and suppression of tumor cells is controlled by antibodies, natural killer cells (NK cells), activated macrophages and cytotoxic T lymphocytes; they perform immunological antitumor responses through diverse methods. The unbalanced immune state, suppressed cell-mediated immunity associated with antitumor action and activated humoral immunity, result in growth of tumor cells. Especially, regulatory T lymphocytes evoke immune tolerance and cytotoxic T lymphocytes are suppressed and inactivated, therefore it is possible that tumor grows rapidly, invades locally and metastasizes to distant organ. A number of investigators have developed T cell lines by expanding tumor associated lymphocytes (TAL) from ovarian ascites or tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from solid tumors with IL-2. But, it is not clear what change occurred in proliferative and suppressive function of regulatory T lymphocytes after ex vivo expansion with IL-2. In order to improve adoptive immunotherapy, we have to know the change of regulatory T lymphocytes after ex vivo expansion of TAL or TIL. The aims of this study were to evaluate the proportions of CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) regulatory T lymphocytes before and after ex vivo expansion of ascites and the difference in the proportions of regulatory T lymphocytes between primary and recurrent ovarian carcinoma.
Materials and methods: Ascitic fluid samples were obtained from 26 patients with ovarian carcinoma treated in Asan medical center from January 2005 to August 2006, among whom 19 patients were primary and 7 patients were recurrent. We isolated lymphocytes from ascites with Ficoll-Hypaque density gradient centrifuge method and analyzed phenotypes of lymphocytes through flow cytometry by using anti CD3 antibodies, anti CD4 antibodies, anti CD8 antibodies, anti CD16/56 antibodies, anti CD25 antibodies and anti FoxP3 antibodies. We cultured these lymphocytes ex vivo with IL-2 for 2~3 weeks and analyzed phenotypes of lymphocytes with same methods.
Results: Lymphocytes increased by larger scale in the recurrent group than in the primary group (p <0.05). The proportion of ex vivo expanded lymphocytes changed as these; CD4^(+) T lymphocytes increased (p <0.05), and as CD8^(+) T lymphocytes decreased (p <0.05). CD3^(-)CD16^(+)56^(+) NK cells showed no change in proportion. This phenomenon was more outstanding in the recurrent group, but not statistically significant. The proportion of CD4^(+)CD25^(high+)FoxP3^(+) regulatory T lymphocytes in CD4^(+) T lymphocytes increased after ex vivo expansion (p <0.05) and by larger scale in the recurrent group (p <0.05).
Conclusion: This study suggests that regulatory T lymphocytes, not cytotoxic T lymphocytes or NK cells, will be expanded by larger scale after immunotherapy for activating immune system, especially in recurrent ovarian carcinoma. These results might play a role in designing immunotherapeutic approaches against ovarian carcinoma.

목차 (Table of Contents)

• 서론 = 1
• 연구대상 및 방법 = 4
• 1. 난소암 환자의 악성복수 채취 = 4
• 2. 난소암 환자의 악성 복수에서 림프구의 분리 = 4
• 3. 림프구의 체외 배양 = 4
• 4. 세포 표식자 분석 = 5
• 5. 조절 T 림프구의 분리 = 7
• 6. 통계분석 = 7
• 연구결과 = 8
• 1. 대상환자의 임상적 특징 = 8
• 2. 악성 복수 림프구의 체외배양 후 림프구의 분포 = 8
• 3. 진단 초기와 재발 후 조절 T 림프구의 분포 = 8
• 고찰 = 17
• 결론 = 22
• 참고문헌 = 23
• ABSTRACT = 26