신경세포 연접소낭의 수송에 미치는 α-synuclein 역할 규명

국문 초록 (Abstract)

탐색대상이 되는 뇌신경세포의 프로테옴을 대표하는 단백질을 발현시키기 위하여, human brain cDNA library를 사용하여 bacteriophage T7 표면상에 외래단백질을 진열함으로써, 단백질의 결합력이라는 기능에 기반을 두고 관련 단백질을 발굴함과 동시에 해당 유전자를 확보하고자 한다. 낮은 빈도로 발현되는 유전자가 다른 풍부한 단백질에 의하여 그 발굴이 저해되거나, 발굴과정 동안 손실되거나, 혹은 높은 빈도로 발현되는 단백질이 false-positive로 선택되는 것을 억제하기 위하여, 유전자 간의 copy-number를 유사하게 조정해준 normalized cDNA library를 제작하여 사용한다. 이는 기존 yeast two-hybrid system 등에 비하여 false-positive의 감소, 낮은 빈도로 발현되는 단백질의 발굴, 특정 형태의 α-synuclein과의 결합력 연구 등의 탁월한 효과가 기대된다.
특이적으로 결합하는 plaques의 염기서열을 결정하여 database로부터 알려진 유전자인지 새로운 유전자인지를 분석한 결과, 기존에 연관성이 알려지지 않은 세포내 막 단백질 X를 코딩하는 것으로 확인되었다 (본인의 unpublished data).
체계적으로 기능을 연구하기 위하여, RACE (rapid amplification of cDNA ends) PCR 기법을 사용하여 full-length cDNA sequence를 확보한다. 확보된 유전자를 다양한 발현체계에서 활성형으로 과발현하고 정제하여 단백질을 생산하고, 해당 단백질에 대한 항체를 제작한다. GST pull-down assay를 통하여 상호작용을 확인하고 생산된 단백질들의 결합력을 정량적으로 분석하기 위하여 Biacore를 사용하여 여러 형태의 α-synuclein에 결합하고 해리하는 속도상수를 구하는 등 심도깊은 특성 연구를 수행한다. In vitro에서 α-synuclein의 결집체 형성을 촉진 혹은 저해하는 지 연구한다. 사람의 도파민신경 세포주인 SH-SY5Y에 α-synuclein과 단백질 X 유전자를 co-transfection 시켜 confocal microscopy를 이용하여 세포 내에 co-localization 되는 지 연구한다. 또한 신경세포 추출액으로부터 α-synuclein과 co-immunoprecipitation 되는 지 살펴본다. 발굴된 단백질의 역할을 연구하기 위하여 SH-SY5Y 세포주에 과발현시켜 연접 소낭의 수송이나 가소성, α-synuclein 결집체 형성을 억제 혹은 촉진하거나 세포 독성에 영향을 미치는지 등을 연구한다.