Deep learning-based prediction of protein thermostability from primary sequences for in silico screening = In silico 스크리닝을 위한 딥러닝 기반 단백질 열안정성 예측

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Protein thermostability, commonly quantified by the melting temperature (Tm), is a key determinant of whether proteins retain their structure and activity under process-relevant conditions. Experimental measurements of Tm using biophysical techniques such as differential scanning calorimetry, fluorescence-based thermal shift assays, circular dichroism spectroscopy, or thermal proteome profiling provide accurate stability information but remain labor-intensive and low-throughput. Existing deep learning–based Tm predictors have begun to address this bottleneck, yet many either exhibit insufficient accuracy for practical prioritization or rely on auxiliary metadata such as optimal growth temperature (OGT), which are rarely available for newly discovered or metagenomic sequences. There is thus a need for a robust, sequence- only Tm prediction model that can support large-scale in silico screening when only amino acid sequences are known. In this study, we developed CSB-E04, a thermostability prediction model that accepts only primary amino acid sequences as input and yields Tm estimates with accuracy suitable for downstream discovery workflows. We curated a non-redundant dataset of 35,680 proteins with experimentally determined Tm values by integrating records from Meltome Atlas and ProThermDB, followed by UniProt-based sequence mapping, removal of non-melters and additive-dependent measurements, and deduplication at the accession and canonical- sequence level. Protein sequences longer than 2,048 residues were truncated to comply with the maximum context length of the ESM-C 600M encoder. CSB-E04 employs ESM-C 600M as a protein language model encoder and a feed-forward neural network regression head applied to pooled sequence embeddings to predict Tm. Five-fold cross-validation on the curated dataset yielded a mean root mean squared error (RMSE) of 5.42 ± 0.06 °C, a mean absolute error (MAE) of 4.04 ± 0.04 °C, and a coefficient of determination (R²) of 0.730 ± 0.004, with corresponding Pearson and Spearman correlation coefficients of 0.855 ± 0.002 and 0.688 ± 0.004, respectively. The best-performing fold, which achieved an RMSE of 5.41 °C, R² of 0.733, and Pearson correlation of 0.856 on its held-out test partition, was adopted as the final model. When compared with previously reported sequence-only models, CSB-E04 improved upon Seq2Topt and DeepET by reducing RMSE by approximately 1–2 °C while explaining a larger fraction of the variance in experimental Tm, and it exhibited performance comparable to metadata-augmented models such as TemBERTure, DeepSTABp, and DeepTM despite relying exclusively on sequence. On an independent external benchmark of 68 proteins that were strictly excluded from model development, CSB-E04 achieved the highest correlations among the tested models (PCC = 0.61; SCC = 0.49), outperforming TemBERTure and DeepSTABp under identical evaluation conditions. These results demonstrate that a protein language model– based, sequence-only architecture can recover much of the thermostability-relevant information encoded in amino acid sequences and provide Tm estimates accurate enough to guide prioritization. CSB- E04 therefore represents a strong sequence-only thermostability predictor for large-scale in silico screening, particularly in metagenomic bioprospecting pipelines where only sequence information is available.

국문 초록 (Abstract)

단백질의 열안정성은 공정 조건에서 구조와 활성을 유지할 수 있는지를 결정하는 핵심 물성으로, 일반적으로 융해온도(melting temperature, Tm)로 정량화된다. Tm은 differential scanning calorimetry (DSC), fluorescence-based thermal shift assays, circular dichroism spectroscopy (CD), thermal proteome profiling (TPP)과 같은 다양한 생물물리학적 기법을 통해 정밀하게 측정할 수 있으나, 단백질 정제, 조건 최적화, 측정 장비 및 시약 비용이 많이 들기 때문에 대규모 단백질 라이브러리나 메타지놈 유래 후보군 전체에 적용하기는 어렵다. 최근 딥러닝과 단백질 언어 모델(protein language model, PLM)의 발전으로 여러 Tm 예측 모델이 제안되었지만, 많은 모델이 실제 스크리닝에 활용하기에는 예측 정확도가 부족하거나, 최적생장온도(optimal growth temperature, OGT)와 같은 보조 메타데이터에 의존한다는 한계를 가진다. 특히 메타지놈 분석을 통해 확보되는 신규 서열들은 아미노산 서열 외의 정보가 거의 없는 경우가 많아, 서열만으로 동작하면서도 높은 예측 성능을 갖는 Tm 예측 모델이 요구된다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 단백질 1차 아미노산 서열만을 입력으로 사용하면서 실제 스크리닝 파이프라인에 활용 가능한 정확도의 Tm을 예측하는 모델 CSB-E04를 개발하였다. Meltome Atlas와 ProThermDB로부터 실험적으로 측정된 Tm 데이터를 수집한 후, 비멜팅(non-melter) 제거, 첨가제 의존 실험 제거, UniProt 기반 서열 매핑 및 중복 제거를 수행하여 총 35,680개의 비중복 단백질–Tm 쌍으로 구성된 데이터셋을 구축하였다. 단백질 언어 모델 ESM-C 600M의 최대 문맥 길이(2,048 잔기)에 맞추기 위해 더 긴 서열은 2,048 잔기까지 절단하였으며, 제안하는 모델은 사전학습된 ESM-C 600M을 시퀀스 인코더로 사용하고, 풀링된 서열 임베딩을 입력으로 하는 다층 퍼셉트론 회귀 헤드를 결합하여 Tm을 예측하도록 설계하였다. 구축된 데이터셋에 대해 5-fold 교차 검증을 수행한 결과, 모델은 평균 RMSE 5.42 ± 0.06 °C, MAE 4.04 ± 0.04 °C, 결정계수 R² 0.730 ± 0.004를 기록하였으며, Pearson 상관계수와 Spearman 상관계수는 각각 0.855 ± 0.002, 0.688 ± 0.004로 나타났다. 다섯 개 fold 중 테스트 세트에서 가장 높은 R²(0.733)를 보인 fold의 모델(RMSE 5.41 °C, PCC 0.856)을 최종 모델로 채택하였다. 기존 서열 기반 모델인 Seq2Topt 및 DeepET과 비교했을 때, CSB-E04는 RMSE를 약 1–2 °C 감소시키고 설명력을 향상시켰으며, OGT나 thermal class와 같은 메타데이터를 추가로 사용하는 TemBERTure, DeepSTABp, DeepTM과 비교하여서도 서열 정보만을 활용하면서 유사하거나 경쟁력 있는 성능을 보였다. 또한 선행 연구에서 보고된 열역학적 안정성 데이터셋을 기반으로 내부 데이터셋과 UniProt accession 수준에서 중복되지 않도록 선별한 68개 단백질로 구성된 독립 벤치마크에서 CSB-E04는 Pearson 상관계수 0.61, Spearman 상관계수 0.49를 기록하여 TemBERTure와 DeepSTABp보다 높은 상관도를 보였다. 이러한 결과는 단백질 언어 모델 기반 서열 전용 아키텍처만으로도 아미노산 서열에 내재된 열안정성 관련 정보를 상당 부분 포착할 수 있으며, 메타데이터가 부족한 메타지놈을 포함한 대규모 in silico 스크리닝에서 안정성이 우수한 효소 후보를 우선적으로 선별하는 필터로 활용할 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figures 1
• List of Tables 2
• Abstract 3
• Introduction 7
• 1) Protein thermostability as a fundamental property 7
• 2) Limitations of experimental Tm assays and the need for sequence-based Tm prediction 10
• 3) Prior research for protein Tm prediction 13
• 4) Objective of this study 14
• Material and Methods 15
• 1) Collection of protein thermostability dataset 15
• 2) Model architecture based on a protein language model 18
• 3) Model training and evaluation 20
• Results 23
• 1) Curated protein thermostability dataset 23
• 2) Cross-validation performance of CSB-E04 on the curated dataset 24
• 3) Comparison with Previous Research 27
• 4) Comparison on benchmark dataset 30
• Discussion 34
• 1) Summary of main findings 34
• 2) Generalization Capability on Independent Benchmarks 34
• 3) Implications for metagenomic bioprospecting and protein engineering 35
• 4) Limitations of current model and dataset 36
• 5) Further work 38
• References 40
• 국문초록 42