효소변환을 통한 상백피 추출물의 티로시나제 저해제 생산 = Production of Morus alba L. Extract as a Tyrosinase Inhibitor through Enzymatic Conversion

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 미백 화장품에 적용 가능한 기능성 화장품 신소재 개발을 하고자 70% 에탄올 상백피 추출물과 효소변환을 통한 생물전환 상백피 추출물을 제조하여 성분분석 하였다. HPLC 성분분석 결과 주 성분은 두 개의 포도당을 포함하고 있는 배당체 구조를 하고 있는 mulberroside A로 확인되었다. Mulberroside A를 효소변환 공정을 통하여 두 개의 당이 모두 제거된 비배당체인 oxyresveratrol로 생물전환 시의 최적 반응 조건을 조사하기 위하여 β-glucosidase, Novozyme, Accellerase로 10시간 처리한 결과 가장 효율성 높은 생물전환 효소로 Accellerase가 탐색되었다. Accellerase에 의한 생물전환 최적 온도와 pH 조건을 결정하기 위한 실험 결과로 Accellerase의 pH는 5.0-6.0, 온도는 40°C가 최적인 것으로 관찰되었다.
70% 에탄올 상백피 추출물과 생물전환 상백피 추출물의 항산화 활성의 변화를 조사하기 위해, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 상백피 추출물 생물전환 전, 후의 항산화 활성은 대표 대조군에 비해 큰 차이를 보이지 않는 것으로 확인되었다. 또한 상백피 추출물의 tyrosinase 저해 효과를 실험한 결과에서도 mulberroside A의 농도가 mushroom-tyrosinase에 대한 저해율을 결정하는 중요 인자임과 mulberroside A가 oxyresveratrol로 전환됨에 따라서 tyrosinase에 대한 저해율이 증가함을 알 수 있었다. 이는 배당체인 mulberroside A보다 비배당체인 oxyresveratrol의 tyrosinase 저해 효과가 월등히 높기 때문이다. L-tyrosine을 기질로 oxyresveratrol의 tyrosinase 저해 효과를 실험한 결과 미백 화장품 공시 시료인 arbutin 보다 oxyresveratrol이 기질의 농도에 따라서 보다 큰 감소효과를 보이는 것이 확인되었다. 생물전환 전, 후의 상백피 추출물의 세포 생존율 측정 결과 두 경우 모두 90% 이상을 유지하여 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 특히, B16-F10 세포를 이용한 각 각의 농도별 arbutin을 처리한 후와 농도별 oxyresveratrol을 처리한 후의 melanin 생성 저해율을 비교한 결과, 같은 농도에서의 arbutin에 비해 oxyresveratrol의 melanin 생성 저해능이 3.3배 우수한 것으로 나타났으며 농도가 높아짐에 따라 melanin 생성 저해 효과도 높아지는 것을 확인할 수 있었다. Arbutin 20 mg/mL과 arbutin 20 mg/mL에 oxyresveratrol 2 mg/mL을 첨가 하여 동시 사용 시의 억제효과는 arbutin 단독 사용 시와 비교하였을 때 3.5배의 상승 효과를 보였으며 oxyresveratrol의 농도의 증가에 따르는 상승효과는 큰 차이를 보이지 않았다. 같은 농도의 arbutin, 생물전환 전, 생물전환 후 상백피 추출물 20 mg/mL을 비교한 결과 arbutin에 비해 생물전환 전, 생물전환 후가 각 각 4배, 5배의 높은 melanin 저해 효과를 보였으며, arbutin에 농도별 생물전환 후 상백피 추출물 동시 사용 시의 melanin 생성 억제 실험 결과 생물전환 후의 상백피 추출물의 농도가 높아짐에 따르는 저해율에 있어 약간의 증가함만을 보여 기대 이상의 큰 상승효과가 관찰되지 않았다. Oxyresveratrol과 arbutin의 저해 형태를 분석한 결과 oxyresveratrol이 비경쟁적 저해 형태로 경쟁적 저해 형태의 arbutin보다 동일 몰수에서 120배 강한 저해력을 가지고 있음을 확인하였다. 이상의 결과를 볼 때 생물전환 상백피 추출물은 resveratrol 보다 뛰어난 tyrosinase 저해 활성을 갖는 우수한 천연 식물 유래의 신소재로서 화장품 산업에서의 유용성이 클 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 이론적 배경 1
• 1.1. 기능성 화장품의 트랜드 1
• 1.2. 미백 화장품 소재 2
• 1.3. 미백 기전 6
• 1.4. Tyrosinase 활성 저해 형태 9
• 2. 효소 활성 저해제 11
• 2.1. 효소반응 속도 11
• 2.2. 가역적 저해제 14
• 2.3. 비가역적 저해제 15
• 2.4. 복합적 저해제 16
• 3. 생물전환 17
• 3.1. 생물전환의 개념과 연구동향 17
• 3.2. 생물전환의 연구 사례 18
• 4. 생물전환 상백피 추출물 19
• 4.1. 상백피 19
• 4.2. 생물전환 상백피 추출물 21
• 4.3. Oxyresveratrol 23
• 5. 연구의 필요성 및 목적 25
• 5.1. 연구의 필요성 25
• 5.2. 연구의 목적 27
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 28
• 1. 실험재료 28
• 1.1. 재료 28
• 1.2. 사용시약 29
• 1.3. 사용기기 29
• 1.4. 상백피 추출물 제조 방법 30
• 1.4.1. 70% 에탄올 상백피 추출물 30
• 1.4.2. 100% 에탄올 상백피 추출물 30
• 1.5. 생물전환 상백피 추출물 30
• 1.5.1. 생물전환 상백피 추출물의 효소 반응 조건 30
• 1.5.2. 상백피 추출물 생물전환율 계산 32
• 1.6. HPLC를 이용한 상백피 추출물 성분 분석 32
• 2. 실험 방법 33
• 2.1. 세포주 33
• 2.2. 세포배양 33
• 2.3. 항산화 활성 측정 33
• 2.3.1. 총 폴리페놀 함량 측정 33
• 2.3.2. 총 플라보노이드 함량 측정 34
• 2.3.3. DPPH 라디칼 소거능 측정 34
• 2.4. Mushroom-tyrosinase에 대한 tyrosinase 저해능 측정 35
• 2.5. 생물전환 상백피 추출물의 세포활성 측정 35
• 2.5.1. Neutral Red assay를 이용한 세포독성 측정 35
• 2.5.2. Melanin 생성 저해능 측정 36
• 2.6. Mushroom-tyrosinase에 대한 저해 형태 37
• Ⅲ. 연구결과 및 고찰 38
• 1. 상백피 추출물의 조성물 성분 분석 38
• 1.1. 70% ethanol 상백피 추출물 HPLC profile 38
• 1.2. 70% ethanol 상백피 추출물의 조성 39
• 2. 상백피 추출물의 생물전환 최적 조건 40
• 2.1. 생물전환에 의한 상백피 추출물의 조성변화 40
• 2.2. 상백피 추출물의 효소별 전환율 43
• 2.3. 상백피 추출물의 생물전환 시간대별 각 생물전환율 44
• 2.4. 상백피 추출물의 Accellerase에 의한 생물전환 최적 조건 45
• 2.4.1. 온도의 영향 45
• 2.4.2. pH의 영향 48
• 3. 생물전환 상백피 추출물의 항산화 활성 측정 결과 51
• 3.1. 총 폴리페놀 함량 측정 51
• 3.2. 총 플라보노이드 함량 측정 53
• 3.3. DPPH 라디칼 소거능 측정 54
• 4. 생물전환 상백피 추출물의 mushroom-tyrosinase 저해력 56
• 4.1. Oxyresveratrol과 arbutin의 mushroom-tyrosinase 저해 59
• 4.2. Arbutin과 oxyresveratrol의 tyrosinase 저해 상승효과 60
• 5. 생물전환 상백피 추출물의 세포 활성 측정 결과 62
• 5.1. Neutral Red assay를 이용한 세포독성 측정 62
• 5.2. Melanin 생성 저해능 측정 65
• 5.2.1. 농도별 arbutin과 oxyresveratrol의 melanin 생성 저해능 66
• 5.2.2. 농도별 arbutin과 arbutin, oxyresveratrol 동시 사용 시의 저해능 68
• 5.2.3. 농도별 arbutin과 농도별 생물전환 전․후 상백피 추출물의 저해능 70
• 5.2.4. 농도별 arbutin과 arbutin, 농도별 생물전환 후 상백피 추출물 동시 사용 시의 저해능 73
• 6. Oxyresveratrol과 arbutin의 저해 형태 75
• 6.1. 저해제가 없을 때 mushroom-tyrosinase에 대한 저해 형태 75
• 6.2. 저해제가 있을 때 mushroom-tyrosinase에 대한 저해 형태 78
• 6.3. 저해 형태에 따른 가상 이미지 84
• Ⅳ. 결론 86
• 참고문헌 90
• 국문초록 104