플라크 순수분리한 수두-대상포진 바이러스의 세포배양 계대에 따른 돌연변이 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Varicella-zoster virus (VZV) causes varicella during primary infection and zoster after reactivation from latency. Both varicella and zoster can be prevented by live attenuated vaccines, and the mechanisms for the attenuation of the vaccines are not clearly elucidated yet. This study aims to understand the mutation events of VZV during cell culture by comparison of the complete genome sequences of plague purified VZV clinical (PP2) and vaccine (PP3) strain. Both PP2 and PP3 strains were passaged in vitro cell culture up to 60 passages and the genome sequences of p4, p30 and p60 were determined. Four substitution mutations were found in PP2, which 59 mutations including 55 substitutions and 4 insertion/deletion were identified in PP3. Most (52/55) of the substitutions in PP3 were transitional and either A→ G or T→ C. Insertional deletions were found in regions with tandem repeat of same nucleotides, and resulted in an early termination in ORF 15. Both infectivity and genome copy number appeared to be increased in high passage p60 than in low passage p4 in PP3. Mutations occurred approximately two-times more during early passaging (p4 to p30) than during late passaging (p30 to p60). Further studies with additional clinical and vaccine strains will help to understand the mechanisms of evolutionary mutation and attenuation of VZV.

국문 초록 (Abstract)

수두 대상 포진 바이러스 (VZV)는 1 차 감염시 수두를 유발하고 잠복기를 거친 후 재활성화 되면 대상 포진을 유발한다. 수두와 대상포진 모두 약독화 생백신으로 예방할 수 있으며, 백신 약독화 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 이 연구는 플라크 순수분리 된 VZV 임상주(PP2) 및 백신주(PP3)의 전체 게놈 서열 비교에 의해 세포 배양 동안 발생되는 VZV의 돌연변이를 이해하는 것을 목표로 한다. PP2 및 PP3 균주는 모두 60 계대까지 시험관내 세포 배양에서 계대되었고 p4, p30 및 p60의 게놈 서열이 결정되었다. PP2에서 4 개의 치환 돌연변이가 발견되었으며, PP3에서 55 개의 치환과 4 개의 삽입/결실을 포함한 59 개의 돌연변이가 확인되었다. PP3에서의 치환의 대부분 (52/55)은 염기전이에 의한 것으로 A→G 또는 T→C였다. 삽입 결실은 동일한 뉴클레오티드가 무작위적으로 반복되는 부위에서 발견되었고, ORF 15에서 조기 종결을 초래했다. PP3의 낮은 계대 p4보다 높은 계대 p60에서 감염성 및 게놈 카피 수가 모두 증가한 것으로 나타났다. 높은 계대 (p30에서 p60까지)보다 낮은 계대 (p4에서 p30까지) 동안 돌연변이가 약 2 배 더 많이 발생 하였다. 임상주 및 백신주에 대한 추가 연구는 VZV의 진화적 돌연변이 및 약독화 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 것으로 예상된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 연구방법 4
• 1. 세포 배양 4
• 2. 수두바이러스의 플라크 순수분리와 계대배양 4
• (1) 플라크 순수분리 5
• (2) 계대배양 5
• 3. 바이러스성 DNA 농축 및 DNA 추출 6
• 4. 차세대 시퀀싱 6
• 5. ORF 위치 정보 7
• 6. 돌연변이 분석 7
• 7. 감염성 바이러스의 정량 8
• 8. 바이러스의 게놈 copy 수 측정 8
• 9. 바이러스 생장곡선 9
• Ⅲ. 결 과 10
• 1. 플라크 순수분리주 (PP2, PP3)의 NGS 결과 10
• 2. PP2의 계대에 따른 돌연변이 10
• 3. PP3의 계대에 따른 돌연변이 10
• (1) ORF에서의 돌연변이 13
• (2) NCR에서의 돌연변이 18
• 4. PP3의 계대배양이 증식에 미치는 영향 21
• 5. PP3의 계대에 따른 염기 치환 양상 24
• 6. PP strain (PP2, PP3)에서 공통으로 발생한 돌연변이 29
• Ⅳ. 고 찰 33
• Ⅴ. 결 론 37
• Ⅵ. 참고문헌 39