재조합 균주 Escherichia coli가 생산하는 Bacillus stearothermophilus Acetyl Xylan Esterase Ⅱ의 정제 및 특성 = Purification and Characterization of Acetyl Xylan Esterase Ⅱ from Escherichia coli Cells Harboring the Recombinant Plasmid pKMG7

국문 초록 (Abstract)

Bacillus stearothermophilus estII 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드인 pKMG7을 가지고 있는 E. coli HB101 균주로 부터 acetylxylan esterase를 다량 생산, 정제하여 그 특성을 조사하였다. 효소 생산 최적 배지는 0.5% galactose, 1% yeast extract 그리고 1% NaCl이었으며 37℃에서 19시간 배양했을 때 가장 높은 효소생산량을 보였다. 생산 esterase는 ammonium sulfate 분획, DEAE- Sepharose CL-6B ion exchange chromatography 및 Sephacryl S-200 gel filtration chromatography 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제하였다. 정제 효소는 pH 6, 45℃에서 가장 높은 활성을 보였고 열에 비교적 안정하였다. 또한 본 효소는 구성 아미노산 잔기 중 methionine, serine, cysteine이 촉매 활성에 필수적인 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 분자량은 gel 여과법으로 약 120 kDa, SDS-polyacrylamide gel 전기 영동법에 의해서는 약 28 kDa으로 측정됨으로써 본 효소분자는 4개의 동일 subunit로 구성된 단백질인 것으로 생각되며 N-말단 아미노산 서열은 Ala-Leu-Phe-Glu-Ser-Arg-Phe-Phe-Ser-Glu-Val-Leu-Gly-Leu로 결정되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Acetylxylan esterase II was produced by Escherichia coli HB101 harboring the recombinant plasmid pKMG7 which contained the estII gene of Bacillus stearothermophilus. Optimal medium for the production of the acetylxylan esterase by E. coli HB101/pKMG7 was determined to contain 0.5% galactose, 1% yeast extract and 1% NaCl. The enzyme produced was purified to homogeneity using a combination of 20∼50% ammonium slufate precipitation, DEAE-Sepharose CL-6B chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration. The temperature and pH optimum of the esterase were 45℃ and pH 6, respectively. The essential amino acids for the esterase activity were found to be methionine, serine, and cysteine. Molecular weight of the esterase ws determined to be 28 kDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and 120 kDa by gel filtration. This suggests that the functional enzyme is a homomeric tetramer. The esterase had an isoelectric point of pH 3.4. The N-terminal amino acid sequence of the enzyme was Ala-Leu-Pe-Glu-Ser-Arg-Phe-Phe-Ser-Glu-Val-Leu-Gly-Leu.