SARS-CoV2 변이종에 대한 베큘로바이러스 기반 DNA 백신 개발 = Development of Baculovirus based DNA Vaccine against SARS-CoV2 Variants

국문 초록 (Abstract)

제2형 신종 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)는 2019년 12월 중국 우한시에서 처음 발병이 보고되면서 전세계적으로 점차 확산되어 2021년 4월경 판데믹으로 선언되었으며 많은 감염자 및 사망자를 초래하였다. SARS-CoV2는 양성 단일 가닥 RNA genome을 지닌 코로나 바이러스로서 동물 및 인간에게 높은 전염성을 가지고 지속적인 변이 바이러스가 출현하고 있는 실정이다.
본 연구에서는 재조합 베큘로바이러스 표면에 인간 내인성 레트로바이러스 Env(Human retrovirus envelop, HERV)를 발현하는 AcHERV DNA 백신 기반 플랫폼을 이용하여 SARS-CoV2에 대한 백신을 제작하였고 그에 따른 면역원성을 평가하였다.
백신 항원으로 SARS-CoV2 스파이크 단백질(S)을 사용하였으며 각각 S 부분, S1 부분, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) N 말단 도메인과 SARS-CoV2 S의 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain, RBD)이 융합한 유전자 부분 등 총 세가지의 백신 항원 후보군을 선정하였다. 이렇게 선정된 백신 항원 후보군들은 AcHERV의 전달체에 삽입하여 백신을 제작하였다. 제작된 AcHERV- COVID19 백신 후보군 3종 중 S 유전자가 도입된 AcHERV-COVID19S 백신의 경우 햄스터 동물모델에서 높은 체액 및 세포성 면역을 유도하였고, SARS-CoV2를 공격접종한 방어능 평가에서 완벽한 방어능을 보였다.
이후 SARS-CoV2 감염에 의한 폐사가 발생하는 형질 전환 실험동물인 K18-hACE2 형질전환 마우스를 이용하여 백신의 효능평가를 진행하였다. AcHERV-COVID19S 백신을 K18-hACE2 형질전환 마우스에 두 번 면역화를 진행하여 높은 체액 및 세포 매개 면역을 유도를 확인하였고, SARS-CoV2를 공격접종에 100% 방어하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 바이러스 감염의 대유행 확산을 예방하는 백신으로서의 가능성을 확인하였다.
그러나, SARS-CoV2 감염을 예방하기 위하여 다양한 종류의 백신들이 개발되어 사용되었음에도 불구하고, SARS-CoV2는 알파부터 델타, 오미크론등 지속적인 변이주가 발생하면서 백신의 효능을 감소시켰다.
AcHERV-COVID19S 백신 역시 K18-hACE2 형질전환 마우스 모델을 이용하여 SARS-CoV2 델타 변이주에 대한 방어능 평가 결과 50%만 생존하였다. 이러한 SARS-CoV2 델타 변이주에 대응하기 위해, AcHERV 백신 기반 플랫폼에 SARS-CoV2델타 변이주의 스파이크 유전자를 도입한 AcHERV-COVID19D 백신을 제작하였고, 교차 방어능 평가를 위해 SARS-CoV2(프로토타입)과 SARS-CoV2 델타 변이주에 대한 효능평가를 진행하였다. 또한 추가적으로 2021년 12월 이후 급속도로 확산되고 있는 SARS-CoV2 오미크론 변이주에 대한 효능 평가도 함께 진행하였다. 면역원성 평가에서는 AcHERV-COVID19D 백신은 프로토타입 또는 오미크론 변이주보다 델타 변이주에 대해 높은 중화 항체 유도를 확인하였고, 3종류의 바이러스에 대한 높은 세포성 면역이 유도되는 것을 확인하였다. 3종류의 SARS-CoV2 바이러스(프로토타입, 델타 및 오미크론 변이주)들을 이용한 교차 방어능 실험에 따르면 AcHERV-COVID19D 백신을 접종한 K18-ACE2 형질전환 마우스는 델타 또는 오미크론 변이주를 공격접종 했을 때 100% 생존하였으며 SARS-CoV2 프로토타입으로 공격접종 했을 때 71.4%의 생존율을 보였다.
이러한 결과는 본 연구에서 개발한 AcHERV-COVID19D 백신은 델타 변이주 뿐만 아니라 오미크론 변이주에 대해서도 예방 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 오미크론 변이주와 같은 경증 병원성을 보이는 다양한 코로나바이러스 변이주에 대한 잠재적인 백신 후보로 사용할 수 있는 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV2) was first reported in Wuhan, China in December 2019, gradually spread worldwide, and a pandemic was declared around April 2021. It caused many infections and deaths. SARS-CoV2 is a positive-sense single-stranded RNA coronavirus, which is highly contagious in animals and humans, and continuously mutated viruses are emerging. We constructed an HERV-enveloped recombinant baculoviral DNA vaccine against SARS-CoV2 (AcHERV-COVID19S), then the immunogenicity and prophylactic effects were evaluated.
For COVID-19 vaccine construction, DNA encoding SARS-CoV2 S-full or S1 or a MERS-CoV NTD domain-fused SARS-CoV2 RBD was inserted into the genome of AcHERV. Among the three prepared AcHERV-COVID19 vaccine candidates, the AcHERV-COVID19 S vaccines induce high humoral and cell-mediated immunity in hamster. In challenge tests, twice immunized AcHERV-COVID19 S showed complete protection against SARS-CoV2.
After that, the efficacy of the vaccine was evaluated using K18-hACE2 Tg mice, which are transgenic experimental animals that cause death due to SARS-CoV2 infection. We immunized K18-hACE2 Tg mice twice with the AcHERV-COVID19S vaccine, confirmed induction of high humoral and cell-mediated immunity, and 100% protection against SARS-CoV2 challenge test. These results support the feasibility of AcHERV-COVID19S vaccines in preventing pandemic spreads of viral infections.
However, despite the development and use of various types of vaccines to prevent SARS-CoV2 infection, SARS-CoV2 reduced the efficacy of the vaccine as persistent variants such as alpha, delta, and omicron occurred.
A non-replicating recombinant baculovirus that delivers the SARS-CoV2 S gene showed a protective effect against homologous challenge in a K18-hACE2 Tg mice model, but only a 50% survival rate against the virulent SARS-CoV2 Delta.
In order to respond to this SARS-CoV2 delta, we developed an AcHERV-COVID19D vaccine in which the SARS-CoV2 delta spike gene was introduced into an AcHERV vaccine-based platform. For cross-protection evaluation, efficacy evaluation was performed on the SARS-CoV2 prototype and the SARS-CoV2 delta varients. In addition, efficacy evaluation of the SARS-CoV2 omicron varient, which has been rapidly spreading since December 2021, was progressed. Cross-protection experiments revealed that mice vaccinated with the AcHERV-COVID19D showed 100% survival under challenge with Delta or Omicron, and 71.4% survival against prototype SARS-CoV2. These results support the potential of the viral vector vaccine, AcHERV-COVID19D, to prevent the spread of coronavirus variants such as Omicron and less pathogenic mutants.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서론 1
• 제1절 코로나바이러스감염증-19(COVID19) 1
• 1. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 구조 1
• 2. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 감염주기 5
• 3. 안지오텐신 전환효소2(ACE2)와 막관통단백질효소 세린2 (TMPRSS2) 8
• 4. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 발생 11
• 5. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 진화 14
• 5.1 코로나바이러스 기원 14
• 5.2 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 진화 18
• 5.3 제2형 델타와 오미크론 변이주의 특성 22
• 6. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 전염 28
• 6.1 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 전파 28
• 6.2 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 진단 30
• 6.3 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 감염증상 31
• 6.4 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 백신 현황 31
• 6.4.1 서브유닛 백신 33
• 6.4.2 바이러스 벡터 백신 34
• 6.4.3 mRNA 백신 34
• 6.4.4 DNA 백신 35
• 6.4.5 사백신 36
• 6.4.6 생백신 36
• 7. 제2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 실험 동물 모델 41
• 7.1 햄스터 41
• 7.2 마우스 42
• 7.3 페렛 44
• 7.4 비인간 영장류 44
• 8. 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 실험 동물 모델 46
• 제2절 베큘로바이러스 벡터 시스템 47
• 1. 베큘로바이러스 47
• 2. AcHERV 재조합 베큘로바이러스 시스템 49
• 제2장 인간 내인성 레트로 바이러스 베큘로바이러스를 기반으로 MERS-CoV 및 SARS-CoV2 백신 개발 51
• 제1절 서론 51
• 제2절 실험 재료 및 방법 52
• 1. 세포 52
• 2. 바이러스 준비 및 역가 측정 53
• 3. 재조합 베큘로바이러스의 구축 53
• 4. 면역형광 및 웨스턴 블랏 분석 68
• 5. 실험동물 68
• 6. 동물 면역화 69
• 7. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 분석 74
• 8. 중동호흡기증후군 및 제2형 신종급성호흡기증후군 코로나바이러스 중화항체 역가 분석 75
• 9. Enzymelinked immuno-spot assay (ELISPOT) 분석 75
• 10. 코로나바이러스 공격접종 실험 76
• 10.1 Ad5-DPP4- BALB/c 마우스의 MERS-CoV 공격접종 76
• 10.2 인간 DPP4 형질전환 마우스의 MERS-CoV 공격접종 77
• 10.3 햄스터의 SARS-CoV2 공격접종 77
• 11. 조직병리학적 분석 77
• 11.1 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 77
• 11.2 면역조직화학(IHC) 77
• 11.3 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 78
• 12. Genomic DNA 분리 및 PCR 방법 81
• 13. GFP 형광 및 FACS 분석 84
• 14. 통계분석 87
• 제3절 결과 88
• 1. 재조합 베큘로바이러스 벡터를 통해 전달되는 MERS-CoV 및 SARS-CoV2 항원의 발현 88
• 2. AD5-DPP4 형질 도입 마우스에서의 MERS-CoV 보호효과 91
• 3. hDPP4 형질전환 마우스에서의 체액성 및 세포성 면역반응 95
• 4. hDPP4 형질전환 마우스에서의 MERS-CoV 공격접종 실험 98
• 5. BALB/C 마우스에서 AcHERV-COVID19 백신의 면역 원성 102
• 6. 시리안 골든 햄스터의 AcHERV-COVID19 백신의 면역 원성 104
• 7. 시리안 골든 햄스터의 SARS-CoV2 공격 접종 실험 106
• 8. 시리안 골든 햄스터의 병리학적 분석 108
• 제4절 고찰 111
• 제3장 SARS-CoV2 변이주에 대한 베큘로바이러스 기반 COVID19 델타 DNA 백신의 교차 방어 평가 113
• 제1절 서론 113
• 제2절 실험 재료 및 방법 116
• 1. 바이러스와 세포준비 116
• 2. 재조합 베큘로바이러스 구축(AcHERV-COVID19D) 116
• 3. 면역 형광 분석 및 웨스턴 블랏 117
• 4. 동물 118
• 5. 마우스 모델에서의 면역화 118
• 6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 분석 119
• 7. 제 2형 신종중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 중화항체 역가 분석 119
• 8. B6.cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn/J 마우스에서의 공격접종 실험 120
• 9. 조직병리학적 분석 120
• 9.1 헤마톡실린-에오신(H E) 염색 (H&E staining) 120
• 9.2 면역조직화학(IHC) 120
• 9.3 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 121
• 10. Enzymelinked immuno-spot assay (ELISPOT) 분석 122
• 11. 사이토카인 mRNA 측정 122
• 12. 통계분석 123
• 제3절 결과 124
• 1. AcHERV-COVID19S 백신의 구축 및 발현 124
• 2. AcHERV-COVID19S 백신의 면역원성 평가 127
• 3. AcHERV-COVID19S 접종한 K18-hACE2 마우스의 SARS-CoV2 공격 접종에 대한 방어능 평가 130
• 4. K18-hACE2 마우스에서 SARS-CoV2 공격 접종에 대한 AcHERV-COVID19S 백신의 조직 병리학적 분석 133
• 5. AcHERV-COVID19S 백신의 세포성 면역 분석 136
• 6. S 단백질의 다염기성 절단 부위에 따른 AcHERV-COVID19D 백신의 효능 평가 138
• 6.1 S 단백질의 다염기성 절단 부위에 따른 AcHERV-COVID19D 백신의 면역원성 비교 141
• 6.2 S 단백질의 다염기성 절단 부위에 따른 AcHERV-COVID19D 백신의 방어능 비교 143
• 7. AcHERV-COVID19S prototype과 AcHERV-COVID19D 델타백신의 면역원성 비교 147
• 8. SARS-CoV2 델타 변이에 대한 AcCHERV-COVID19D 델타백신의 방어능 평가 150
• 9. 재조합 아데노바이러스 제작 154
• 10. SARS-CoV2 변이 바이러스들에 대한 AcHERV-COVID19D DNA 백신의 교차 방어 평가 156
• 10.1 AcHERV-COVID19D의 교차 체액성 면역 평가 158
• 10.2 SARS-CoV2 변이주에 대한 AcHERV-COVID19 백신의 교차 방어능 평가 160
• 제4절 고찰 163
• 참고문헌 166
• ABSTRACT 199

참고문헌 (Reference)

1. Genome structure , replication , and pathogenesis」, Chen , Y. , Q. Liu , et al.「Emerging coronaviruses, 92 ( 4 ) ,, , 2020

2. A novel technology for safe and expeditious vaccine production for human use」, Safdar , A. and M. M. Cox.「Baculovirus-expressed influenza vaccine, 16 ( 7 ), , 2007

3. Expression of Chimeric Influenza Hemagglutinin Antigen ( cH7/3 ) using the Baculovirus Expression System and Identification of its Biological Activities ], Wang , D. , K. Qin , et al.「, 31 ( 5 ), , 2015