Expression of antioxidant enzymes in H4IIE cells infected by retrovirus containing GFP : GFP 표지 retrovirus에 감염된 H4IIE 세포에서의 항산화 효소 발현

국문 초록 (Abstract)

Retrovirus를 이용한 형질전환 기술은 사람의 유전자 치료에 사용되고 있다. 유전자 치료에 사용되는 retrovirus vectors에 대해 사람의 조혈줄기 세포에서 retrovirus vectors의 결합에 의한 백혈병 위험성에 대해서 제기되고 있다. 그러나 retrovirus를 이용한 형질전환 세포에서의 항산화 효소 변화에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 실험의 목적은 Green fluorescent protein (GFP)로 표지된 retrovirus에 감염된 H4ⅡE 세포에서의 산화제에 대한 항산화 능력을 평가하는 것이다. 정상 H4ⅡE 세포와 비교하여 retovirus의 감염으로 인한 H4ⅡE 세포에서의 glutathione (GSH)과 malondialdehyde (MDA)의 함량과 라디칼 제거 능력에는 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다. 그러나 H_(2)O_(2) 와 t-BHP에 대한 반응성에서는 차이가 관찰되었다. H_(2)O_(2) 처리에 의한 세포독성과 GSH의 고갈, MDA의 상승에 대해서 형질 전환된 H4ⅡE 세포가 더 높은 저항성을 나타내었다. 반면에 t-BHP 처리에 의한 세포독성과 GSH의 고갈, MDA의 상승에 대해서는 형질 전환된 H4ⅡE 세포가 더 낮은 저항성을 나타내었다. 형질 전환된 H4ⅡE 세포에서의 항산화 효소 단백질들(glutamylcysteine ligase, superoxide dismutase Ⅰ, superoxide dismutase Ⅱ, catalase, glutathione peroxidase Ⅰ, pi-class glutathione S-trasferase)의 유의성 있는 변화는 없었다. 그러나 alpha-class glutathione S-trasferase (alpha-class GSH)는 2.5배 증가하였다. 반면에 GSH reductase (GR)은 78% 감소하였다. 위 결과들은 GFP 표지 retrovirus의 감염으로 인해 H4ⅡE 세포에서 항산화 효소발현이 변했음을 의미한다. 본 실험에서 alpha-class GST와 GR의 발현 변화는 형질 전환된 H4ⅡE 세포와 정상 H4ⅡE 세포에서의 산화제에 대한 다른 반응성에 기인한 것으로 제안된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Retroviral transgenic technology is frequently used for human gene therapy. The leukemogenic risk of integrating retroviral vectors in hematopoietic stem cell has raised safety concerns for the use of integrating gene transfer vectors for human gene therapy. There have been no reports for changes in antioxidant defense system in transgenic cells infected by retrovirus. In this study, we evaluate the antioxidant capacity against oxidant in H4ⅡE cells infected by retrovirus containing green fluorescent protein (GFP). Contents of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA), and radical scavenging capacity were not changed by infection with retrovirus. However, transgenic H4ⅡE cells showed different response to H_(2)O_(2) or tert butylhydroperoxide (t-BHP) compared with normal H4ⅡE cells. Transgenic H4ⅡE cells exhibited significantly higher ability resistant to cytotoxicity and GSH depletion and MDA elevation induced by H_(2)O_(2) compared with normal H4ⅡE cells. In contrast transgenic H4ⅡE cells showed significantly lower ability resistant to cytotoxicity and GSH depletion and MDA elevation induced by t-BHP compared with normal H4ⅡE cells. Expression of antioxidant enzymes (glutamylcysteine ligase, superoxide dismutase Ⅰ, superoxide dismutase Ⅱ, catalase, glutathione peroxidase Ⅰ and pi-class glutathione S-transferase) in transgenic H4ⅡE cells was not significantly altered. Alpha-class glutathione S-transferase (alpha-class GST) protein levels in transgenic cells increased about 2.5 fold relative to levels monitored in normal H4ⅡE cells. In contrast glutathione reductase (GR) protein levels declined to 78% of levels monitored in normal H4ⅡE cells by infection with retrovirus. These results show that the expression of antioxidant enzymes is changed in H4ⅡE cells by infection with retroviral vector containing GFP. The present study suggests that alteration of alpha-class GST and GR expression may attribute to different response to oxidants between transgenic and normal H4ⅡE cells.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = Ⅰ
• CONTENTS = Ⅲ
• List of Figure = Ⅴ
• List of Scheme = Ⅶ
• Abbreviations = Ⅷ
• Introduction = 1
• 1. Oxidative stress = 1
• 2. Antioxidant defense system = 5
• 3. GFP = 10
• 4. Retroviral-mediated transgenic technology using retrovirus vector = 14
• Ⅱ. Materials and methdods = 16
• 1. Materials = 16
• 1.1. Cell culture = 16
• 1.2. Reagents = 16
• 1.3. Instruments = 17
• 2. Methods = 18
• 2.1. Cell culture = 18
• 2.1.1. Preparation of GSH sample = 18
• 2.1.2. Preparation of LPO cell lysate sample = 19
• 2.1.3. Preparation of immunoblot cell lysate sample = 20
• 2.1.4. Preparation ofTOSC cell lysate = 20
• 2.2. Concentration-response cell viability assay = 20
• 2.3. Protein assay = 21
• 2.4. Determination of total GSH = 22
• 2.5. Determination of MDA = 22
• 2.6. TOSC assay = 23
• 2.6.1. Oxyradical generation system = 23
• 2.6.2. The condition of gas chromatography analysis of ethylene = 24
• 2.6.3. Quantification of TOSC = 24
• 2.7. Immnoblot analysis = 24
• 2.8. Statistical analyses = 25
• Ⅲ. Results = 26
• 1. The cytotoxicity induced by H_(2)O_(2) and t-BHP in H4IIE-GFP and H4IIE cells = 26
• 2. Total Glutathione amount in H4IIE and H4IIE-GFP cells = 30
• 3. The lipid peroxidation in H4IIE and H4IIE-GFP cells = 34
• 4. TOSC = 38
• 5. Antioxidant enzyme expression in H4IIE and H4IIE-GFP cells. = 46
• Ⅳ. Discssion = 58
• Ⅴ. Conclusion = 62
• Ⅵ. Reference = 63
• 초록 = 70
• Acknowledgement = 72