메실산독사조신의 반복투약 생체이용률시험 및 표준지침 작성 = Development of the Standard Protocol of Bioequivalence Study : Bioavailability Study of Doxazosin Mesylate

국문 초록 (Abstract)

국내 의약품 제제들의 의약품동등성시험을 조속하고 효과적으로 추진하기 위해 성분별로 대조약 선정하고 이의 생체이용률 시험법을 표준화함으로써 생물학적동등성시험을 효율적이고 경제적으로 추진할 수 있는 기반을 조성할 필요성이 있다. 메실산독사조신 서방정의 대조약인 카두라엑스엘 정 4 mg (한국화이자)의 반복 투약 생체이용률을 측정하기 위한 분석법을 3개 기관이 형광 검출에 의한 액체크로마토그래프법으로 검토하여 검증하고, 각 기관별로 생체이용률시험을 순차로 행하여 메실산독사 조신 서방정의 생물학적동등성시험의 표준적인 시험법을 제시하고자 하였다. 각 기관별로 혈중 독사조신 분석법을 형광 검출에 의한 액체크로마토그래프법으로 확립하였다. 최종 선정한 분석조건으로는 역상 C18 칼럼을 가지고 검토한 결과 독사조신과 내부표준물질인 프라조신이 양호하게 분리되어 특이성이 있었으며, 1～50 ng/mL의 농도범위에서 상관계수 0.999 이상의 양호한 직선성을 나타내었다. 정량한계농도(1 ng/mL)에서 정밀성이 3개 기관 모두 C.V.(%)가 모두 6% 미만이었으며 일내 정확성과 정밀성의 평균값은 모두 9% 이하이었으며, 일간 정확성과 정밀성의 평균값도 모두 13% 이하로 양호하였다. 감도는 신호대 잡음비를 10으로 하였을 때 1 ng/mL로 산출되 었다. 추출법에 의한 독사조신 및 내부표준물질의 회수율은 모두 95% 이상이었다. 분석법의 표준지침으로 칼럼으로는 역상 C18 칼럼(5 ㎛, 4.6 × 250 mm)을 쓰고 tert-부틸메칠에텔 로 추출하고 0.005 mol/L 황산으로 역추출 (내부표준물질로 염산프라조신 함유)하여 그 30 ㎕를 HPLC에 주입하고 이동상으로 물․아세토니트릴․트리에칠아민혼합액 (68 : 32 : 0.1, pH 5.0 묽은인산)을 써서 유속 1.2 mL/min으로 유출시키고 여기파장 246, 형광파장 389 nm에서 내부표준물질과 프라조신을 각각 약 4.7 및 3.9분에서 검출하여 1 ～ 50 ng/mL의 농도범위에서 작성한 검량선으로부터 혈장 중 독사조신의 농도를 측정하였다. 메실산독사조신 서방정 4 mg의 투여량은 8일간 1일 1회 반복투여하고 1정(4 mg)을 물 240 mL로 경구투여하였다. 8일째 투약 직전, 투약 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 24시간째에 채혈하여 혈장을 분리하여 분석시까지 -20℃ 이하에 보존하였다. 각 기관별로 건강한 피험자 8인을 대상으로 카두라엑스엘정 4 mg을 경구투여하고 5, 6, 7, 8일째 투약전 농도와 투약간격 중 채혈한 혈장을 검증된 분석법으로 혈중농도를 측정하여 생체이용률 파라미터를 구하였다. 그 결과 AUCτ, Css․max, Tmax, Ke, t₁/₂, Css․min 및 Tmin 값은 각각 357.8 ± 16.8 ngㆍhr/mL, 20.7 ± 1.4 ng/mL, 6.7 ± 2.3 hr, 0.0281 ± 0.005 hr⁻¹, 27.8 ± 8.2 hr, 11.4 ± 0.45 ng/mL 및 1.7 ± 0.51 hr로 나타났다. 이러한 결과는 문헌에 보고된 내용과 유사하였다. 이상의 결과를 볼 때 이 연구에서 확립한 분석법과 반복 투약 생체이용률시험 방법은 메실산독사조신 서방정의 생물학적동등성 시험의 표준적인 방법으로 활용될 수 있다고 생각된다.○ 연구목표 : 본 연구에서는 서방성 제제인 메실산독사조신을 선정하여 혈장 중 독사조신의 분석법을 확립하고 반복투여에 의한 생체이용률시험을 수행하여 생물학적동등성시험 지침을 마련하고자 하였다. 이를 통해 메실산독사조신과 같은 서방성 제제의 생물학적동등성시험의 활성화를 기하고 의약품 동등성 시험 관리의 효율화를 기할 수 있을 것으로 예상된다. 또한 모든 전문의약품의 허가에 있어 생물학적 동등성시험을 의무화하고 생물학적 동등성시험을 토대로 한 의약품 재평가가 원활히 수행될 수 있는 기반을 구축하는데 한 몫을 담당할 수 있을 것으로 기대된다.
○ 연구내용 : 메실산독사조신 서방정의 생체이용률시험은 혈중약물분석방법의 확립을 위해 제1세부기관(동덕여자대학교), 제2세부기관(이화여자대학교) 및 제3세부기관(강원대학교)의 3개 기관이 분석법을 검토하여 확립하고, 각각 확립된 분석법을 비교 고찰하여 표준분석법을 제시하였다. 이 방법으로 제1세부기관에서 생체이용률을 시험하고, 제2세부기관에서는 제1세부기관에서 얻은 결과를 바탕으로 채혈시간 등을 개선하여 생체이용률시험을 수행하며, 제3세부기관에서는 채혈시간 확립 등 최종 시험법 지침 작성을 위한 반복 투약 생체이용률시험을 수행하였다. 매 시험기관마다 반복 투여하여 얻은 혈장중 농도를 통계 처리하여 8시간째 투약 후 정상상태에 도달하였으며 투여간격 중 혈장농도곡선아래면적(AUCτ), 정상상태에서의 최고혈중농도 (Css․max), 최고혈중농도 도달시간(Tmax), 소실속도정수(Kel), 소실반감기(T₁/₂β), 정상상태에서의 최저혈중농도 (Css․min) 및 최저혈중농도도달시간(Tmin)은 각각 357.8 ± 16.8 ng․hr/mL, 20.7 ± 1.4 ng/mL, 6.7 ± 2.3 hr, 0.0281 ± 0.005 hr⁻¹, 27.8 ± 8.2 hr, 11.4 ± 0.45 ng/mL 및 1.7 ± 0.51 hr로 나타났다. 주관기관에서 각 기관의 시험결과를 총괄 검증하여 최종 메실산독 사조신 서방성 제제의 표준 생체이용률시험 지침을 작성하였다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 메실산독사조신 서방정의 표준 생물학적동등성시험 표준지침을 마련함으로써 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다. 첫째, 메실산독사조신 제제의 동종약 간의 생물학적동등성시험의 수행을 신속히 완료하는 데에 기여함으로써 대체조제를 원활히 하고 의약분업의 정착에 기여한다. 둘째, 한국인에 있어서 약물동태학적 파라미터의 확립으로 약물요법에 활용할 수 있다. 셋째, 메실산독사조신의 새로운 제제 연구개발 및 약물동태연구에 필요한 in vivo 연구 자료로 활용 한다. 또한 메실산독사조신 서방정은 물론 기타 다른 제형의 생물학적동등성 시험의 in vivo 연구의 시험자료로 활용할 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Validated high-performance liquid chromatographic determination of doxazosin in human plasma was developed using fluorescence detection, and multiple dose bioavailability study of Cadura XL Tablets 4 mg (reference drug: Pfizer) was conducted sequentially in three different institutions. From the plasma doxazon concentration vs. time curves obtained from 24 healthy volunteers during dose interval after attainment of steady state, the following pharmacokinetic parameters were obtained. The steady state was assumed to be attained 8th day after oral administration once a day. The area under the plasma concentration-time curve (AUCτ), peak plasma concentration (Css․max), time to reach peak plasma concentration (Tmax), and elimination half-life (t₁/₂β), trough plasma concentration (Css․min) and time to reach trough concentration (Tmin) were found to be 357.8 ± 16.8 ng․hr/mL, 20.7 ± 1.4 ng/mL, 6.7 ± 2.3 hr, 0.0281 ± 0.005 hr⁻¹, 27.8 ± 8.2 hr, 11.4 ± 0.45 ng/mL and 1.7 ± 0.51 hr, respectively. Based on the evaluation of analytical conditions and assay validation obtained from three different institutions, the protocol for the bioequivalence study of doxazosin controlled-release (CR) tablets was suggested as follows. Human plasma samples (0.5 mL) spiked with known concentrations of doxazosin and 15 ng of prazosin HCl as an internal standard are treated with 200 ㎕ of 2 mol/L sodium hydroxide solution and extracted with 3 mL of tert-butylmethyl ether for 1 min. Extracts are centrifuged and 2 mL-portions of organic layer are back-extrated with 0.3 mL of 0.005 mol/L sulfuric acid. Thirty microliters of centrifuged aqueous layer are injected into the RP octadecyl column and eluted with a mixture of water, acetonitrile and triethylamine (68 32 : 0.1, v/v, pH 5.0 with diluted phosphoric acid) at a flow rate of 1.2 mL/min. Fluorescence detector is set at 246 nm (excitation) and 389 nm (emission). Using this assay method, multiple dose bioavailability study is conducted to investigate the pharmacokinetic behavior and bioequivalence of doxazosin CR tablets in 8 healthy Korean volunteers 8th day after attainment if steady state. Each volunteer receives one tablet of 4 mg dose with 240 mL of water once a day for 8 days. Following oral administration at 8th day, plasma samples are obtained at 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 hour, and doxazosin concentrations in plasma samples are determined by above methods using a calibration curve constructed in the concentration range 1 ～ 50 ng/mL. Assay results obtained are statistically evaluated according to the bioequivalence guidance of KFDA.