Enterococcus sp. RKY1에 의한 푸마르산으로부터 숙신산 생물전환 = Bioconversion of fumaric acid to succinic acid by enterococcus sp. RKY1

국문 초록 (Abstract)

숙신산과 그 유도체들은 농업, 식품, 의약품, 플라스틱, 화장품, 직물, 도금, 가스세정과 1,4-부탄디올, 테트라히드로푸란, γ-부티로락톤 등의 생산에 유용한 중간물질이다. 숙신산은 현재 산업적으로 석유를 원료로 하는 화학적 방법으로 생산되고 있으나 앞으로의 석유자원고갈 및 환경문제 등의 이유로 생물학적인 방법에 의한 숙신산 생산에 큰 관심이 집중되고 있다. 또한 글리세롤은 바이오 디젤의 제조시 부산물로 다량 생산되어 폐기 및 재 이용성에 따라 생산비용을 크게 좌우하는 매우 중요한 항목으로 거론되고 있다. 따라서 본 연구에서는 수소공여체로서 글리세롤과 수소수용체로서 푸마르산염을 이용하여 숙신산염으로의 생물전환을 실시하고자 전환능력이 뛰어난 새로운 통성 박테리아를 분리·동정하여 그 특성을 조사하였으며 생성된 발효산물을 이용하여 푸마르산염 첨가로 인해 변형된 탄수화물 대사경로를 추정하였다. 또한 여러 배양 및 배지조건의 최적화를 위한 기초실험 및 계면활성제를 이용하여 생산성 증진을 시도하였으며 Rhizopus 속 곰팡이 균주를 이용하여 글루코오스로부터 푸마르산을 직접 생산하여 푸마르산 발효액으로부터 숙신산 생물전환을 행하였다.
새로이 분리된 통성박테리아는 1㎛의 구형 그램 양성 박테리아로서 Enterococcus 속으로 동정되어 Enterococcus sp. RKY1으로 명명하였다. 한편 이 미생물은 글리세롤과 푸마르산 기질하에서 고농도의 숙신산을 생산하였으며 글리세롤 산화로 생성된 피루브산이 phosphoroclastic과 dismutation 경로를 통해 대사되어 그 외 부산물로 아세트산과 포름산을 생성하였다. 시험된 여러 수소공여체 중 글리세롤이 가장 효과적이었으며 푸마르산염 기질하에서 숙신산염 생성량이 가장 많았다. 푸마르산은 Na_(2)CO_(3)를 중화제로 이용한 푸마르산 나트륨염 형태가 가장 양호하였다. 최적 배양 배지 조건은 온도 38℃, pH 7.0이었으며 주된 기질로서 20 g/l glycerol, 80 g/l fumarate (Na염 형태), 15 g/l yeast extract와 그 외 무기염 및 금속이온으로는 10 g/l K_(2)HPO_(4), 1 g/l NaCl, 50 ppm MgCl_(2)·6H_(2)O, 10 ppm FeSO_(4)·7H_(2)O 였다.
고농도 세포배양 (2 g/l)에 의한 숙신산염 생성량은 초기 푸마르산염 농도 30, 50, 80과 100 g/l 각각에 대하여 29.3, 40.9, 63.6과 82.5 g/l 였으며, 초기 푸마르산염 농도가 증가함에 따라 숙신산염 생성량도 증가함을 알 수 있었다. 최대수율은 초기 푸마르산염 농도 30 g/l에서 96.8%로 가장 높은 값이 얻어졌으며 재래발효와 비교하여 숙신산염 생산성이 2.5배 정도 증진되었다. 유가식 배양을 행하여 배양 36시간 만에 숙신산염 생성량은 153 g/l였으며 평균 숙신산염 부피생산성은 4.25 g/l/h를 보였다. 칼슘 알지네이트에 고정화된 세포는 여러 차례의 재사용 (9회)에도 활성이 유지되어 생산공정의 단순화 및 연속생산의 가능성이 모색되었다. 저농도의 비이온 계면활성제, 유기용매, 식물성 기름을 배지내에 첨가함으로 숙신산염 생산성은 증진되었으며 시험된 농도 중 최적 농도는 각각 0.1 g/l Tween 80, 10 ml/l 아세톤과 1 g/l 옥수수유였다. 각각의 조건에서 24시간 발효 조 배양 실험결과 1 g/l 옥수수유 및 0.5 g/l Tween 80과 50 ㎍/l 비오틴 혼합배양의 경우 두 조건에서 약 85 g/l 숙신산염이 생성되어 가장 양호하였으며 대조용 실험과 비교하여 생산성이 약 25% 증진되었다. 옥수수유의 첨가로 인한 숙신산 생산성 증진은 숙신산이 식품, 의약품, 화장품 등에 크게 이용되는 점을 고려할 때 다른 유기 용매에 비해 상당히 바람직하였다.
Rhizopus 속을 이용한 글루코오스로부터 푸마르산의 생산은 중화제로서 Na_(2)CO_(3)를 이용한 발효 실험결과 배양 4일째에 약 26 g/l의 푸마르산염이 생성되었는데 푸마르산 나트륨염 형태의 생성물 회수는 균사체의 재이용 및 전환기질의 직접 이용 등의 이유로 유리하였다. 이러한 푸마르산염 25 g/l를 함유하는 발효액을 특별한 전처리없이 전환기질로 이용하여 87.9% 수율의 22.3 g/l의 숙신산염을 얻을 수 있었다.
따라서 본 연구에 수행된 생물전환공정은 전환기질이 거의 모두 순수한 형태의 숙신산으로 매우 빨리 전환되어 원료의 전처리 및 회수·정제공정을 단축함은 물론 그에 소요되는 비용을 절감할 수 있어 산업화의 경우 효율적임을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Succinic acid is widely used as a specialty chemical with applications in polymers, foods, pharmaceuticals, and cosmetics, and as a four-carbon intermediate it is useful for the production of 1,4-butanediol, tetrahydrofuran, and γ-butyrolactone. Succinic acid can be produced either chemically or biologically, but is currently being produced commercially by chemical processes. Bioconversion of fumarate to succinate was anaerobically conducted with a synthetic medium containing glycerol as a hydrogen donor and fumarate as a hydrogen acceptor. Glycerol can be obtained as a byproduct during the manufacture of biodiesel fuel from rape oil.
In this study, the identification and characteristics of a newly isolated facultative bacterium were investigated, and the culture conditions and medium optimization were examined for the bioconversion. Studies were also conducted using various surface active agents to obtain improved product yield. Fumaric acid fermentation by Rhizopus oryzae was carried out and the conversion of this fermentation to succinic acid fermentation was performed.
A bacterium, RKY1, has been selected from culture samples of strictly anaerobic bacterium. Based on the morphological and physiological characteristics, the isolated RKY1 was identified as Enterococcus sp. and was named Enterococcus sp. RKY1.
It was postulated that fumarate reacted with the reduced NAD generated in the oxidation of glycerol, and thus altered the role of pyruvate in the regeneration of oxidized NAD. The metabolism of pyruvate via the dismutation and phosphoroclastic pathways would then account for the increased growth response and the volatile acid and carbon dioxide production.
Glycerol was found to be most efficient in promoting the reduction of fumarate to succinate and the efficacy of fumarate appeared to be due to its playing a role as a hydrogen acceptor. Neither glycerol nor fumarate alone produced succinic acid as well as an increase in cell growth. Na-fumarate (as Na_(2)CO_(3)) was the form most readily utilized by the bacteria for the conversion. The optimum condition of bioconversion was obtained with media containing 20g/L glycerol, 80g/L fumarate, 15g/L yeast extract, 10 g/L K_(2)HPO_(4), 1 g/L NaCl, 50 ppm MgCl_(2)·6H_(2)O, 10 ppm FeSO_(4)·7H_(2)O at pH 7.0∼7.6.
When the initial cell density was high (2g/L), the succinate produced at pH 7.0 for initial fumarate concentrations of 30, 50, 80, and 100g/L was 29.3, 40.9, 63.6, and 82.5g/L, respectively, showing an increase corresponding with the initial fumarate concentration. The high yield of 96.8% per mole of fumarate in just 4 hours was obtained at the initial fumarate concentration of 30g/L. Comparing this value to that obtained through conventional fermentation, we found that the production rate in this study was about 2.5 times higher.
Addition of a variety of surface active agents to the medium provided 25% increase in the production rate of succinate. In general, 0.1g/L Tween 80, 10mL/L acetone, and 1g/L corn oil increased succinate production. It is likely that the fatty acid esters contained in the agents alter the permeability of the cell membranes. Among the several agents tested, corn oil was more efficient than others. Since succinic acid is primarily used in the production of food, medicine and cosmetics, vegetable oil was also considered the most proper agent in the production of succinate.
Fumaric acid production through microbial fermentation yielded 26g/L of culture. The broth, containing sodium fumarate, was then used for the succinic acid fermentation with conversion yields as high as 87.9% after 5hours.
Thus very attractive and effective culture conditions for production of succinic acid from fumarate using glycerol as a hydrogen donor were established.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• (초록) = vii
• I. 서론 = 1
• 1.1 연구배경 = 3
• 1.1.1 생물전환기술 및 활용 = 3
• 1.1.2 숙신산 생산 전자전달 반응기구 = 6
• 1.1.3 숙신산 생물학적 생산 = 14
• 1.1.3.1 역사적 배경 = 14
• 1.1.3.2 관련기술의 검토 = 19
• 1.1.3.3 용도 = 21
• 1.1.4 푸마르산의 생물학적 생산 = 23
• 1.2 연구의 범위 및 내용 = 24
• II. 재료 및 방법 = 28
• 2.1 균주의 분리 및 특성 = 28
• 2.1.1 생물전환 균주의 분리 = 28
• 2.1.2 형태학적 특성 = 28
• 2.1.3 배양학적 특성 = 29
• 2.1.4 생리학적 특성 = 29
• 2.1.5 세포벽 지방산 분석 = 29
• 2.1.6 탄수화물 발효산물 및 생물전환능력의 비교 = 29
• 2.2 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 실험 = 31
• 2.2.1 사용 균주 = 31
• 2.2.2 배지 및 사용 시약 = 31
• 2.2.3 배양 실험 = 32
• 2.2.4 고정화 비드의 제조 = 34
• 2.3 푸마르산의 생물학적 생산 = 34
• 2.3.1 사용균주 및 배지 = 34
• 2.3.2 배양 실험 = 35
• 2.3.3 고정화 비드의 제조 = 35
• 2.4 푸마르산 발효액으로부터 숙신산 생산실험 = 37
• 2.5 분석 방법 = 37
• 2.5.1 전자현미경 관찰 = 37
• 2.5.2 글루코오스 농도 측정 = 37
• 2.5.3 글리세롤 농도 측정 = 38
• 2.5.4 단백질 정량 = 38
• 2.5.5 세포농도 측정 = 38
• 2.5.6 유기산 정량 = 39
• III. 결과 및 고찰 = 40
• 3.1 균주의 분리 및 특성 = 40
• 3.1.1 생물전환 균주의 선정 = 40
• 3.1.2 균주의 특성 = 40
• 3.1.2.1 형태학적 특성 = 41
• 3.1.2.2 배양학적 특성 = 41
• 3.1.2.3 생리학적 특성 = 41
• 3.1.2.4 지방산 분석 결과 = 46
• 3.1.3 균주의 분류 및 동정 = 46
• 3.1.4 탄수화물 발효 및 생물전환능력의 비교 = 49
• 3.1.5 글리세롤과 푸마르산염 발효생성물의 대사경로 분석 = 53
• 3.2 푸마르산으로부터 숙신산으로의 생물전환 = 60
• 3.2.1 생물전환 기초 실험 = 60
• 3.2.1.1 수소공여체 및 수소수용체의 영향 = 60
• 3.2.1.2 중화제 및 접종량의 영향 = 62
• 3.2.1.3 온도 및 환경조건의 영향 = 65
• 3.2.1.4 질소원의 영향 = 68
• 3.2.1.5 무기 및 금속이온의 영향 = 71
• 3.2.2 생물전환 속도 확인 = 76
• 3.2.3 탄소원 및 푸마르산염의 영향 = 78
• 3.2.3.1 탄소원 종류의 영향 = 78
• 3.2.3.2 푸마르산염 농도의 영향 = 78
• 3.2.3.3 글루코오스 농도의 영향 = 83
• 3.2.3.4 글리세롤과 푸마르산염 몰비 구성 실험 = 83
• 3.2.4 pH의 영향 = 86
• 3.2.4.1 초기 pH의 영향 = 86
• 3.2.4.2 고정 pH의 영향 = 86
• 3.2.5 초기 기질농도의 영향 = 88
• 3.2.5.1 저농도 세포배양에서의 영향 = 88
• 3.2.5.2 고농도 세포배양에서의 영향 = 92
• 3.2.6 푸마르산염에서 숙신산염으로의 생물전환 = 95
• 3.2.7 유가식 및 고정화 세포배양을 이용한 생물전환 = 95
• 3.2.8 계면활성제를 이용한 생물전환 증진실험 = 102
• 3.2.8.1 여러 종류의 계면활성제를 이용한 기초실험 = 102
• 3.2.8.2 최적 계면활성제의 발효조 배양 = 113
• 3.3 푸마르산의 생물학적 생산 = 122
• 3.3.1 고정화 세포를 이용한 플라스크 배양 실험 = 122
• 3.3.2 발효조 배양실험 = 127
• 3.4 푸마르산 발효액으로부터 숙신산 생산 = 129
• IV. 결론 = 131
• ABBREVIATIONS = 133
• REFERENCES = 135
• (Abstract) = 146