DNA메틸화 표지자를 이용하여 고형성 장기 암종을 혈액에서 진단하는 방법 개발 = Blood-based detection of solid organ cancers using DNA methylation markers

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성
프로모터 CpG islands의 이상 메틸화에 의한 유전자 불활성화 기전은 인체 암종의 발생에 중요한 역할을 하며, 인체의 거의 모든 암종에서 발견되고, 유전자변이에 비해 훨씬 많은 유전자들이 동시다발적으로 메틸화되어 있고, 이로 인해 발현이 억압되어 있음. 유전자 변이를 종양표지자로 활용하기에는 각 장기 암종에서 변이율이 낮은 편이며, 또한, 모든 엑손을 full sequencing을 해야 하기에 현실적인 검사가 되기가 어려움. 또한, hot spot을 가지면서 높은 변이율을 보이는 유전자는 매우 예외적이고, 한정된 장기의 암종에서 볼 수 있음. 이에 반해, 프로모터 CpG island loci의 메틸화는 매우 높은 빈도로 인체의 각 장기 암종에서 관찰되며, 또한 인체 장기암종에서 공통적으로 발견되는 것이 있는가 하면, 또 한편으로 각 장기암종에 특이적으로 메틸화되는 프로모터 CpG island loci가 있기 때문에, 종양표지자로서 활용될 여지가 많음. CpG island 메틸화는 매우 안정적인 화학적 변화이기 때문에, 단백질표지자나 RNA표지자에 비해, 샘플의 보관상태에 영향을 덜 받으며, 오래 보관된 표본에서도 검사가 가능함. 혈액을 이용하여 암을 진단할 수 있다면, 조직검사가 어려운 복강내 장기의 암종진단에 유용하게 활용될 수 있을 것임. 본 연구과제는 혈액속에 유리되어 있는 암세포 기원 DNA를 메틸화 마커를 이용하여 검출함으로써, 암종의 존재 유무뿐만 아니라, 어떤 장기의 암종인지를 예측할 수 있는 검사방법 및 DNA메틸화 마커를 확립 및 발굴하고자 하였음.
Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위
위암, 대장암, 간암에 대해 새로운 DNA메틸화마커를 개발하기 위해 Illumina Co의 Goldengate methylation solution을 적용하여, 각각의 정상조직에 비해 과메틸화되고 있는 유전자들을 찾은 후, 이들에 대해 methylation specific PCR방법을 이용하여 과메틸화여부를 확인하였음. 확인된 유전자들을 실제의 암조직을 대상으로 MSP를 시행하여, 암조직에서 암특이적으로 메틸화가 일어나는 DNA메틸화마커를 발굴하였음. 기존에 확보하고 있는 63개의 유전자 프로모터 CpG island loci에 대해 위암, 간암, 대장암, 폐암 원발조직 및 각각의 정상조직을 대상으로 MethyLight assay를 시행하였고, 이를 통해 각 암종에 암특이적인 DNA메틸화마커를 결정하였음. 위암, 간암, 대장암, 폐암 환자 혈장과 비암종성 만성질환 환자 혈장, 정상인 혈장을 대상으로 63개 유전자에 대한 MethyLight assay를 시행함으로써, 각 장기의 암종에 특이적인 메틸화를 보이는 DNA메틸화마커를 결정하였음. 간암의 경우, 암조직과 혈액상에서 DNA메틸화프로필을 쌍으로 비교함으로써, 혈액에서 덜 검출되는 간암의 병리학적 특성을 파악할 수 있었음.
Ⅲ. 연구개발결과
간암과는 달리 위암, 폐암, 대장암의 경우 혈액내에서 DNA메틸화검출율이 높지 않음을 알 수 있었음. 이에, 간암에 대한 혈액진단 DNA메틸화마커 패널을 개발하고자, training set (간암과 만성간염환자의 혈장), test set (간암과 만성간염환자 혈장), validation set (간암과 다른 장기암종환자의 혈장)으로 구성하여 18개 DNA메틸화마커에 대해 메틸화분석을 시행하였고, 그 결과 간암을 진단할 수 있는 메틸화마커패널을 구성하였으나, 간암이 아닌 타장기암종과의 변별력은 만족스러운 수준은 아니었음.
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획
집단암검진에 활용될 수 있도록 검사를 손쉽게 할 수 있게 패널을 구성하는 마커의 수를 최대한 최소화하여 단일 튜브내에서 패널마커 모두를 함께 검사할 수 있도록 간편화시키기 위한 검사가 이루어져야 할 것임. 이를 위해 추가적인 연구가 필요함.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

I. Aims and necessity of the present project
Promoter CpG isalnd hypermethylation is a ubiquitous phenomena in human cancers, regardless of tissue type and the number of genes inactivated by promoter CpG island hypermethylation exceeds that of genes mutated by genetic changes in human cancers. Thus, promoter CpG island hypermethylation-associated gene inactivation plays an important role in the genesis of human cancers. Promoter CpG island hypermethylation attracts an attention for their utility as tumor biomarkers because genetic changes are difficult to detect and their detection requires hist cost and long time but epigenetic change is relatively easy to detect and costs low. Furthermore, CpG island methylation is very stable becauce it is a covalent chemical changes occuring double stranded DNAs and resists degradation induced by storage on room temperature. And DNA methylation analysis might do a critical role in body fluid-based diagnosis of human cancers because degraded tumor cells can be easily detected by DNA methylation analysis. DNA methylation markers are also utilized for prognostication and prediciton of human cancers. The present study aimed to develop DNA methylation marker panels which enable blood-based detection of human cancers of internal organs, especially liver cancer.
Ⅱ. Contents and scope
In order to develop new DNA methylation markers for gastric cancer, colon cancer, and liver cancer, we utilized Illumina Co.'s Goldengate methylation solution and obtained lists of genes, which were subsequently analyzed for their methylation in cancer cell lines by methylation-specific PCR. After then, those genes which were confirmed to be hypermethylated in cancer cell lines were analyzed for their methylation status in primary cancer tissues using MSP. These approaches produced novel DNA methylation markers for these main cancers. We also analyzed four tissue types of human cancers for their methylation status in 63 DNA methylation markers using MethyLight assay. Through comparison with corresponding normal tissues, we could determine lists of cancer-specific DNA methylation markers for these main types of human cancers. And we also analyzed plasma DNA from the patients with these main types of human cancers for their methylation status in the 63 DNA methylation markers, which were compared with those of non-cancer patients as a control. Through this, we were able to understand which markers were cancer-associated and further tissue-type specific or non-specific. Through paired samples of tissue and blood DNAs from cancer patients, certain pathologic characeristics contribute to release of cancer cell DNAs into bloodstream, especially tumor size.
Ⅲ. Results of reseach and development
We found that blood-based detection of internal malignancies using DNA methylation markers were more promising for liver cancer compared with other malignancies because detection rates of DNA methylation markers in blood DNA samples were low compared with those from liver cancer patients. Thus, we determined to develop DNA methylation marker panels which enable blood-based detection of liver cancer and differentiate from chronic liver disease patients. We selected 18 DNA methylation markers from initial screening and performed training set, tester set, and validation set approach. We were able to to develop DNA methylation marker panels which were useful for detection and differentiation of liver cancer from chronic liver disease but were not enough to differentiate from other tissue type malignancies.
Ⅳ. Application plan of research and development results
In order to be widely applicable for mass screening of cancer, DNA methylation marker panels have to be simplified so that panel markers could be tested within a single tube. Further development will be directed toward this goal.