Methylomic, proteomic and phenotypic analyses of DNA methyltransferases in plant pathogenic Xanthomonas spp.

국문 초록 (Abstract)

Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag)와 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)는 각각 콩에서 콩불마름병과 토마토와 고추에서 세균성 점무늬병을 일으키며, 이러한 병으로 인해 작물 생산량이 감소되기 때문에 Xag와 Xcv는 매우 중요한 식물 병원성 세균이다.
DNA 메틸화효소는 S-adenosyl-L-methionine으로부터 유래된 메틸기를 특정 DNA 염기서열에 전이하는 효소이다. DNA 메틸화효소가 관여하는 생물학적 기작에 대한 연구는 주로 동물 병원성 세균에서 활발히 진행되어 왔으며, DNA 메틸화효소에 의한 특정 DNA 부분의 메틸화로 인하여 하위 유전자의 발현이 조절된다고 밝혀졌다. 또한 세균의 병원성에 중요한 기작인 운동성이나 생체막 형성을 조절한다는 사실도 보고되고 있다. 이렇게 DNA 메틸화효소의 중요성이 밝혀지고 있지만, 식물 병원성 세균의 DNA 메틸화효소에 대한 연구가 깊이 이루어진 바가 없기 때문에, 본 연구에서는 식물 병원성 세균에서 DNA 메틸화효소의 기능을 구명하였다.
먼저, 단분자 염기서열 분석법을 이용하여 유전체 수준에서 메틸화 된 DNA 염기와 메틸화 부위의 유형을 확인하였다. Xag strain 8ra와 Xcv strain 85-10을 분석한 결과, 두 세균에서 공통적으로 N6-methyladenine (6mA)과 N4-methylcytosine (4mC)을 확인할 수 있었다. 또한, 두 종 모두에서 이전에 보고되지 않은 메틸화 부위를 발견하였다.
다음으로, Xag에서 DNA 메틸화효소인 EadM의 기능을 EadM 과발현 균주를 제작하여 분석하였다. 단백체와 표현형 분석을 통하여 EadM이 병원성, envelope 생합성, siderophore 생산, 스트레스 저항성, exopolysaccharide 생산에 관여함을 확인하였다. 또한, 비교 단백체 분석과 GEN III plate 분석을 이용하여 메틸화효소로 추정되는 XgMT1, XgMT2, XgMT3의 기능을 예측하였다.
Xcv에서는, 두 개의 메틸화효소(XvDMT1과 XvDMT2)를 과발현시킨 균주인 Xcv(XvDMT1)과 Xcv(XvDMT2)를 제작하여 XvDMT1과 XvDMT2가 인식하는 염기서열 부위와 기능을 연구하였다. 비교 단백체와 표현형 분석을 통해 두 메틸화효소는 병원성, 단당류 이용, exopolysaccharide 생산, 스트레스 저항성, 혹은 생체막 형성에 관여하고 있음을 입증하였다. 또한 단분자 염기서열 분석과 제한효소를 이용하여 XvDMT1과 XvDMT2가 각각 6mA와 5mC DNA 메틸화효소인 것을 구명하였고 두 효소에 의한 DNA메틸화 부위를 밝혀냈다. 또한, XvDMT1과 XvDMT2에 의해 조절되는 ScpBXv (ScpB-like protein in Xcv)의 역할을 분석하여, ScpBXv가 Xcv에서 병원성과 성장, biofilm 형성을 조절한다는 것을 확인하였다.
이 연구는 이전에 보고되지 않은 식물 병원성 세균의 DNA 메틸화효소의 기능에 대한 연구로, Xag와 Xcv의 DNA 메틸화효소의 기능과 병원성과의 관계를 구명하였다. 이러한 결과는 아직까지 밝혀지지 않은 병원성 발현 기작의 확립과 원핵생물의 세포학적 생물학적 행동을 이해함으로서 환경 친화적인 식물 병 제어제의 개발에 작용점으로 활용 될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) are phytopathogenic bacteria causing a bacterial pustule disease in soybean and a bacterial spot disease in tomato/pepper, respectively. DNA Methyltransferases (MTases) modify adenine and cytosine by adding a methyl group from S-adenosyl-L-methionine within specific recognition sites. In animal pathogenic bacteria, functions of DNA MTases have been known to be involved in regulation of gene expression, motility, biofilm formation and interaction with host cells, supporting bacterial virulence. Despite their importance, mechanisms underlying DNA MTase-related functions in phytopathogenic bacteria have not been reported.
Single-molecule real-time (SMRT) sequencing allows the identification of methylated DNA bases and methylation patterns/motifs at the genome level. Using the SMRT sequencing, the methylomes of Xag str. 8ra and Xcv str. 85-10 were analyzed. Completely methylated bases of N6-methyladenine (6mA) and N4-methylcytosine (4mC) were determined in the genomes. In addition, putative DNA methylation motifs including previously unreported methylation motifs were successfully assigned in both species.
Next, the functions of a DNA MTase, EadM, were characterized using an EadM-overexpressing strain in Xag. Using proteomic and phenotypic analyses, it was shown that EadM was associated with virulence, envelope biogenesis, siderophore production, stress tolerance, and exopolysaccharide production. In addition, the functions of 3 putative Xag MTases, XgMT1, XgMT2, and XgMT3 were postulated using a label-free shotgun comparative proteomic analysis and the GEN III plate assay.
In Xcv, the functions of two DNA MTases, XvDMT1 and XvDMT2, were characterized by generating XvDMT1- and XvDMT2-overexpressing strains, respectively. Phenotypic and proteomic analyses revealed that XvDMT1 and/or XvDMT2 were involved in virulence, growth in monosaccharides, EPS production, biofilm formation and stress tolerance in Xcv. Using the SMRT sequencing and methylation-sensitive restriction endonucleases, it was demonstrated that XvDMT1 and XvDMT2 are site-specific 6mA and 5mC DNA MTases, respectively, which have not been reported in bacteria. The expression of segregation and condensation protein B (ScpB), which is essential for replication and segregation in living organisms, regulated by XvDMT1 and XvDMT2, and the roles of ScpBXv (ScpB-like protein in Xcv) was further characterized by phenotypic and proteomic analyses.
This study provides valuable and fundamental information regarding functions of DNA MTase, which are previously unreported, and leads to new insights into cellular and biological mechanisms involved in virulence in prokaryotic organisms.

목차 (Table of Contents)

• 1. General Introduction 1
• 2. Methylome analysis of two Xanthomonas spp. using single-molecule real-time sequencing 7
• 2.1 Introduction 7
• 2.2 Materials and Methods 9
• 2.3 Results and Discussion 12
• 2.4 Summary 31
• 3. Research on Xanthomonas axonopodis pv. glycines 33
• 3.1 Functional characterization of a DNA methyltransferase, EadM, in Xanthomonas axonopodis pv. glycines by proteomic and phenotypic analyses 33
• 3.1.1 Introduction 33
• 3.1.2 Materials and Methods 36
• 3.1.3 Results 43
• 3.1.4 Discussion 70
• 3.1.5 Summary 77
• 3.2 Profiling differently abundant proteins affected by three putative methyltransferases in Xanthomonas axonopodis pv. glycines using comparative proteomic analyses 79
• 3.2.1 Introduction 79
• 3.2.2 Materials and Methods 80
• 3.2.3 Results and Discussion 85
• 3.2.4 Summary 120
• 4. Research on Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 122
• 4.1 Two site-specific DNA methyltransferases are involved in virulence, growth in monosaccharides, EPS production, biofilm formation or stress tolerance in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 122
• 4.1.1 Introduction 122
• 4.1.2 Materials and Methods 124
• 4.1.3 Results 131
• 4.1.4 Discussion 190
• 4.1.5 Summary 193
• 4.2 Functional and proteomic analyses reveal that ScpBXv is involved in bacterial growth, virulence, and biofilm formation in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 195
• 4.2.1 Introduction 195
• 4.2.2 Materials and Methods 197
• 4.2.3 Results and Discussion 200
• 4.2.4 Summary 221
• 5. Conclusion 223
• References 226
• 6. Appendix Comparative proteomic analysis of three Xanthomonas spp. cultured in minimal and rich media 242
• 국문초록 357