Periostin-binding DNA aptamer treatment attenuates renal fibrosis under diabetic conditions : 당뇨병성 신병증에서 periostin-binding DNA aptamer가 신섬유화에 미치는 영향

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Diabetic nephropathy, the major cause of chronic kidney disease, is associated with progressive renal fibrosis. Recently, accumulation of periostin, an extracellular matrix (ECM) protein, was shown to be implicated in renal fibrosis. Aptamers, which are novel oligonucleotides that bind to specific target molecules, are proven to have higher binding affinity without developing the common side effects of antibodies. In addition, the cost of aptamer production is lower than that of small molecules, making the former a promising pharmaceutical candidate.
Purpose: This study was aimed to examine the therapeutic roles of a periostin-binding DNA aptamer in renal fibrosis under diabetic conditions. The direct impact of periostin inhibition by a novel aptamer-based inhibitor on TGF-β1-induced extracellular matrix synthesis in cultured inner medullary collecting duct (IMCD) cells was investigated. The effects of the periostin-binding DNA aptamer on renal fibrosis were also evaluated in animal models of diabetic nephropathy.
Methods: To regulate the functional role of periostin, a periostin-binding DNA aptamer (PA) that was generated to target human periostin was used. For in vitro studies, IMCD cells were incubated in DMEM/F12 media, and they were exposed to TGF-β1 (10 ng/ml) with or without PA (100 nmol/l). After 48 hr, the cells were harvested. In vivo, unilateral nephrectomy was performed in C57/BL6 mice. After one wk, they were intraperitoneally injected with saline (N=16) or streptozocin (50 mg/kg/d) (N=16) to induce diabetes. db/db mice (N=16) and nondiabetic db/m mice (N=16) were also used. Eight mice from each group were treated with PA (500 µg/kg/d). RNA and protein expression of periostin, fibronectin, and type I collagen in IMCD cells and mouse kidneys were determined by real-time polymerase chain reaction and western blot analysis, respectively. Immunohistochemistry (IHC) and Sirius Red staining were also conducted.
Results: In vitro, TGF-β1 treatment significantly up-regulated periostin, fibronectin, and type I collagen mRNA and protein expression in cultured IMCD cells, and these increases were significantly attenuated in PA-treated IMCD cells exposed to TGF-β1. In vivo, fibronectin and type I collagen mRNA and protein expression were significantly increased in the kidney of diabetic mice, and PA administration significantly abrogated the increases in renal fibronectin and type I collagen expression in diabetic mice. IHC and Sirius Red staining also revealed that fibronectin expression was significantly higher and tubulointersititial fibrosis was significantly severer in the kidney of diabetic mice compared to control mice, and these changes were clearly ameliorated with PA treatment.
Conclusion: These findings suggest that inhibition of periostin using a DNA aptamer can be a potential therapeutic strategy against renal fibrosis in diabetic nephropathy.

국문 초록 (Abstract)

배경: 당뇨병성 신병증은 투석이나 이식이 필요한 말기 신부전증의 가장 흔한 원인 질환이다. 당뇨병성 신병증의 특징적인 병리학적 변화는 사구체 및 세뇨관의 비후와 세포 외 기질의 축적이며, 이러한 변화에 transforming growth factor (TGF)-β1이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Periostin은 세포 외 기질 단백 중 하나로, integrin과 관련된 세포 내 신호전달체계를 활성화시켜 fibronectin 및 collagen과 같은 세포 외 기질의 축적을 유도한다. 최근에는 periostin의 발현과 신섬유화 사이에 밀접한 연관이 있다는 연구 보고도 있었다. 따라서, periostin의 발현이나 기능을 조절하는 것이 신섬유화의 발생 및 진행에 영향을 미칠 것으로 생각되나, 아직 이에 대한 연구는 전무한 실정이다.

목적: 본 연구에서는 내수질 집합관 배양세포에서 periostin의 기능을 조절하기 위하여 올리고뉴클레오티드이면서, 특정 물질과 특이하게 결합하는 성질을 가지고 있고, 항체에 비하여 강한 결합력을 보이는 동시에 부작용이 적으면서도 합성 비용이 저렴하다는 장점을 가지고 있는 aptamer가 TGF-β1에 의한 세포 외 기질의 생성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한, periostin-특이 DNA aptamer의 효과를 당뇨병성 신병증 동물 모델에서도 조사하였다.

방법: 생체 외 실험으로 마우스 내수질 집합관 배양세포를 이용하여 TGF-β1 (10 ng/ml)을 처리한 후 세포 외 기질의 생성 변화를 확인하였다. Periostin의 기능을 규명하기 위한 실험에는 periostin-특이 DNA aptamer (100 pmol/ml)를 이용하였다. 생체 내 실험으로는 두 가지 모델의 당뇨 마우스를 사용하였다. 첫 번째 모델은 C57BL/6 마우스로 32마리 중 16마리에서는 일측 신절제술을 시행한 1주일 후 streptozotocin (STZ) 50 mg/kg를 5일 간 매일 복강 주사하였다 (UNXSTZ) (N=16). 대조군과 제 1형 당뇨 UNXSTZ군에서 각각 8 마리씩에는 periostin-특이 DNA aptamer (500 µg/kg/d)를 복강 내로 7주 간 매일 주사하였다. 두 번째 모델은 제 2형 당뇨군 db/db 마우스 (N=16)와 대조군인 db/m 마우스 (N=16)로, 각 군에서 8마리씩에는 periostin-특이 DNA aptamer (500 µg/kg/d)를 복강 내로 9주 간 매일 투여하였다. 각각의 마우스를 희생시키기 1주일 전에는 24시간 뇨를 수집하여 뇨중 알부민 배설량을 측정하였으며, 희생 후에는 신장 조직을 채취하였다. 배양세포 및 신장 조직에서의 periostin, fibronectin, 그리고 type I collagen의 mRNA 발현은 real-time PCR을 이용하여 분석하였으며, 각각의 단백 발현은 western blot으로 평가하였다. 신장 조직의 섬유화 정도는 Sirius Red 염색으로 관찰하였으며, fibronectin에 대한 면역조직화학 염색도 시행하였다.

결과: 집합관 배양세포에서 TGF-β1을 처리한 결과, periostin, fibronectin, 그리고 type I collagen의 mRNA 및 단백 발현은 의미있게 증가되었으며, 이러한 TGF-β1에 의한 발현 증가는 periostin-특이 DNA aptamer를 동시에 투여하였을 때에 의의있게 완화되었다. 생체 내 실험에서도 제 1형과 제 2형 당뇨 마우스 모두에서 신장 내 periostin, fibronectin, 그리고 type I collagen의 mRNA 및 단백의 발현이 유의하게 증가되었다. Sirius Red 염색을 이용하여 평가한 신장 내 섬유화 정도도 당뇨 마우스에서 의미있게 심하였으며, fibronectin에 대한 면역조직화학 염색상으로도 신장 내 fibronectin의 단백 발현이 당뇨 마우스에서 의의있게 증가되었다. 당뇨 마우스에서의 이러한 변화는 복강 내 periostin-특이 DNA aptamer 투여로 유의하게 반전되었다.

결론: 이상의 결과를 종합하여 볼 때, periostin-특이 DNA aptamer는 당뇨병성 신병증과 연관된 신섬유화의 예방 및 치료에 유용할 것으로 생각된다.