Development of Mature iPSC-Cardiac Spheroids via Gelatin Nanoparticles = 젤라틴 나노입자를 활용한 성숙한 유도만능줄기세포 유래 심근 스페로이드의 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Replicating the hierarchical and dynamic nature of the native cardiac microenvironment within a three-dimensional engineered construct remains a major frontier in stem cell–driven cardiac research. Although induced pluripotent stem cell–derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) offer an inexhaustible, patient-specific, and clinically adaptable cell source, their application is fundamentally constrained by persistent immaturity. iPSC-CMs typically exhibit fetal-like sarcomeric organization, inefficient calcium handling, underdeveloped electrophysiological coordination, and incomplete metabolic maturation, all of which hinder their ability to recapitulate adult myocardial function. Conventional two-dimensional culture systems and macroscale biomaterial platforms fail to provide the spatial confinement, coordinated cell–cell interactions, and finely tuned microenvironmental cues required to support synchronized, tissue-level cardiac behaviors. These limitations significantly reduce the physiological relevance, reproducibility, and translational utility of current in vitro cardiac models. To overcome these challenges, this thesis introduces a unified nanoengineered strategy that integrates gelatin nanoparticles (GNPs) with conventional U-well and inclined microwell (IM) platforms to promote the structural and functional maturation of iPSC-CM spheroids. The inclined microwell architecture provides enhanced geometric confinement that facilitates uniform cell aggregation, improved spheroid compaction, and long-term structural stability. Simultaneously, GNPs serve as ECM-mimetic nanoscale biochemical modulators, delivering localized bioactive cues that enhance cell–cell connectivity, cytoskeletal organization, and microenvironmental remodeling within the three-dimensional spheroid. The integrated platform enables precise control over spheroid formation and allows systematic evaluation of GNP concentration dependent effects on spheroid geometry, viability, ultrastructural organization, molecular maturation, and electrophysiological performance. Compared with conventional U-well systems, IM platforms consistently yielded spheroids with superior size uniformity, higher compaction efficiency, and improved reproducibility. Incorporation of optimized concentrations of GNPs further amplified these effects, leading to enhanced sarcomeric alignment, increased expression of cardiac maturation markers, improved gap-junction continuity, elevated metabolic activity, and more stable and regular electrical activity. Collectively, these results demonstrate a synergistic interaction between nanoscale microenvironmental confinement and nanoparticle-mediated biochemical modulation. Overall, this work establishes a scalable and reproducible nanoengineered platform for generating high-fidelity human cardiac spheroids with advanced structural and functional maturation. By bridging microarchitectural control with nanoscale biochemical regulation, the proposed system provides a robust foundation for physiologically relevant cardiac tissue models and holds strong potential for applications in cardiac regeneration, drug toxicity screening, and disease modeling.
Keywords: Nanoengineering, gelatin nanoparticles, induced pluripotent stem cell, cardiomyocyte maturation, cardiac spheroids

국문 초록 (Abstract)

자연 심근 미세환경이 지니는 계층적이고 동적인 특성을 삼차원 공학적 구조 내에서 재현하는 것은 줄기세포 기반 심장 연구 분야에서 여전히 중요한 도전 과제로 남아 있다. 유도만능줄기세포 유래 심근세포(iPSC-CMs)는 고갈되지 않는 환자 맞춤형 세포원으로서 임상적 활용 가능성이 매우 높지만, 지속적인 성숙도 부족으로 인해 실제 적용에는 근본적인 한계를 가진다. iPSC-CMs는 일반적으로 태아형 근절 구조, 비효율적인 칼슘 처리 능력, 미성숙한 전기생리학적 그리고 불완전한 대사 성숙을 보이며, 이러한 특성은 성인 심근 기능을 충실히 모사하는 데 장애로 작용한다. 기존의 이차원 배양 시스템과 거시적 바이오 소재 기반 플랫폼은 동기화된 조직 수준의 심장 기능을 지탱하는 데 필요한 공간적 구속, 조화로운 세포–세포 상호작용, 그리고 정밀하게 조절된 미세환경
신호를 제공하지 못한다. 그 결과, 현재의 in vitro 심장 모델은 생리적 적합성, 재현성, 그리고 전임상적 활용 측면에서 상당한 제약을 가진다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 연구에서는 젤라틴 나노입자와 기존 U-well 및 경사형 마이크로웰(IM) 플랫폼을 통합한 나노공학적 접근 전략을 제안하여 iPSC-CM 스페로이드의 구조적·기능적 성숙을 촉진하고자 하였다. IM 구조는 향상된 기하학적 구속을 제공함으로써 균일한 세포 응집을 유도하고, 스페로이드의 응축도와 장기 구조 안정성을 효과적으로 향상시킨다. 동시에 GNPs는 ECM을 모사하는 나노스케일 생화학적 조절자로 작용하여, 삼차원 스페로이드 내부에서 국소적인 생체 활성 신호를 전달하고 세포–세포 연결성, 세포골격 조직화, 그리고 미세환경 재형성을 촉진한다.
본 통합 플랫폼은 스페로이드 형성 과정을 정밀하게 제어할 수 있으며, GNP 농도에 따른 스페로이드 기하학적 특성, 생존성, 초미세구조 조직화, 분자적 성숙도, 그리고 전기생리학적 성능 변화를 체계적으로 평가할 수 있도록 설계되었다. 기존 U-well 시스템과 비교하였을 때, IM 플랫폼은 일관되게 우수한 크기 균일성, 높은 응축 효율, 그리고 향상된 재현성을 보이는 스페로이드를 생성하였다. 또한 최적화된 농도의 GNP를 도입함으로써 이러한 효과는 더욱 증폭되어, 근절 정렬의 향상, 심근 성숙 마커 발현 증가, 갭 정션 연속성 강화, 대사 활성 증진, 그리고 보다 안정적이고 규칙적인 전기적 활동이 관찰되었다. 이러한 결과는 초소형 미세환경 구속과 나노입자 기반 생화학적 조절 간의 시너지 효과를 명확히 입증한다. 종합적으로, 본 연구는 고도의 구조적·기능적 성숙을 갖는 고정밀 인간 심근 스페로이드를 재현성 있고 확장 가능하게 제작할 수 있는 나노공학적 플랫폼을 확립하였다. 미세구조 수준의 기하학적 제어와 나노스케일 생화학적 조절을 효과적으로 연결함으로써, 제안된 시스템은 생리적으로 타당한 심근 조직 모델 구축을 위한 견고한 기반을 제공하며, 향후 심장 재생 치료, 약물 독성 평가, 그리고 심장 질환 모델링을 포함한 다양한 응용 분야에서 높은 잠재력을 지닌다.

목차 (Table of Contents)

• Content
• List of Figures i
• 1. INTRODUCTION 3
• 1.1. General introduction 3
• 1.2. Objectives 7
• 1.3. Reference 9
• 2. Chapter 2. Nanoengineered Strategies for Enhancing iPSC-CM Spheroid Maturation 12
• 2.1. Summary 12
• 2.2. Introduction 14
• 2.3. Limitations of Conventional iPSC-Derived Cardiomyocyte Spheroids 16
• 2.3.1. Structural and Functional Immaturity 16
• 2.3.2. Reduced Electrophysiological and Calcium Signaling 18
• 2.3.3. Metabolic Immaturity of iPSC-CM Spheroids 19
• 2.4. Role of ECM-Mimetic Microenvironments in Cardiac Maturation 20
• 2.4.1. Importance of Cell–Cell and Cell–ECM Interactions 20
• 2.4.2. Biophysical and Biochemical Cues in 3D Cardiac Systems 22
• 2.5. Gelatin as a Cardiac-Relevant ECM-Derived Biomaterial 23
• 2.5.1. Physicochemical and Biological Properties of Gelatin 23
• 2.5.2. Advantages of Gelatin for Cardiac Tissue Engineering 24
• 2.5.3. Characterization and Fabrication of Gelatin Nanoparticles 25
• 2.6. Gelatin Nanoparticles for Engineering 3D Cardiac Spheroid Microenvironments 27
• 2.6.1. Physicochemical Characterization of GNPs 27
• 2.6.2. Structural Stabilization and Spheroid Compaction by GNPs 29
• 2.6.3. Concentration Dependent Effects of GNPs on iPSC-CM Maturation 30
• 2.6.4. Effects of GNP-Integrated on iPSC-CM Maturation in U-well Plate 31
• 2.6.5. Functional Maturation of GNP-Integrated iPSC-CMs in U-well Plate 34
• 2.7. Engineering Requirements for Uniform and Scalable Cardiac Spheroid Platforms 36
• 2.7.1. Size Controllability and Reproducibility 36
• 2.7.2. Long-Term Structural Stability and Scalability 37
• 2.8. Inclined Microwell Platforms for Advanced Cardiac Spheroid Formation 38
• 2.8.1. Limitations of Conventional U-well Platforms 38
• 2.8.2. Design Principles of the Inclined Microwell Platform 39
• 2.8.3. Advantages of IM Platforms for Cardiac Spheroid Engineering 40
• 2.9. Conclusion 41
• 2.10. Reference 43
• 3. Chapter 3. Engineering of GNP-Integrated iPSC-CM Spheroids Using U-well and IM
• Platforms 47
• 3.1. Summary 47
• 3.2. Introduction 48
• 3.3. Materials and methods 49
• 3.3.1. Differentiation of iPSCs into Cardiomyocytes 49
• 3.3.2. Generation of GNP-Integrated iPSC-CM Spheroids 50
• 3.3.3. Comparative Analysis of Spheroid Formation in U-well and IM Platforms 51
• 3.3.4. In vitro Spheroid Viability and Functional Maturation Analyses 54
• 3.3.5. Electrophysiology Assessment 58
• 3.4. Results and Discussion 61
• 4. Chapter 4. Conclusion and Future Perspectives 62
• 4.1. Summary 64
• 4.2. Significance of the GNP-Integrated IM Cardiac Spheroid Platform 64
• 4.3. Limitations 65
• 4.3. Future Applications 66
• 4.4. Reference 67
• Abstract (Korean) 69