Bacillus 속 DP-152가 생산하는 생물고분자 응집제에 관한 연구 = (A) Study on the Bioflocculant from Bacillus sp. DP-152

국문 초록 (Abstract)

각종 산업분야에서 적용되고 있는 합성응집제는 응집처리 후, 2차 오염이 사회적으로 문제화되면서 이러한 문제를 해결할 수 있는 새로운 응집제의 개발 요구가 점차 확대되고 있다. 따라서 미생물이 생산하는 고분자 응집제는 기존의 합성 응집제의 단점을 극복할 수 있는 유일만 응집제로서 선진 각국에서 경쟁적으로 개발을 서두르고 있다. 이러한 측면에서 본 연구에서는 미생물이 생산하는 고분자 물질인 다당류를 개발하여 폐수처리용응집제로 사용하기 위한 목적으로 토양으로부터 응집제를 생산하는 균주를 분리, 동정하였으며, 분리균주의 응집제 생산성을 검토하고, 생산된 응집제의 물성 및 이화학적 성질을 조사하였으며, 또한 각종 산업폐수에서의 응집실험과 중금속 흡착실험을 실시하였다. 각종 시료에서 분리한 200여중의 미생물 가운데 생육이 양호하고 활성탄과 kaolin에 응집활성이 가장 높은 균주인 DP-152f를 선별하였다. 분리한 균주의 형태학적, 생리학적 및 화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus 속으로 동정되어, 분리균주 DP-152를 Bacillus 속 DP-152로 명명하였다.
Bacillus 속 DP-152 균주가 응집제를 생산하기 위한 최적배지 조성은 l 당 soluble starch 30 g, NH_(4)NO_(3) 0.75 g, K_(2)HPO_(4) 2 g, KH_(2)PO_(4) 0.1 g, MgSO_(4)·7H_(2)O 0.2 g, MnSO_(4)·4H_(2)O 0.4g 및 NaCl 0.4 g이었다. 최적배양 온도는 30℃였으며, 최적 pH는 8.0이었고 최적 C/N비는 40이었다. 이러한 조건을 이용한 jar fermentor에서는 배양 50시간에서 최고의 응집활성을 보였으며, 배양액의 점도는 약 70,000 centipoise 이고 다당류 생산량은 liter당 약 10 g이었다.
Bacillus 속 DP-152가 생산하는 웅집제의 주 응집원은 다당류로 확인 되었으며, 응집제 DP-152는 fucose : galactose : glucose : mannose 가 16: 27 : 86 : 42의 몰비로 구성된 새로운 다당류이며, 적외선 분장분석 결과응집제 DP-152는 구조내에 -OH기, C-H기, C=O기, CH_(2) bond가 존재하였고, ^(1)H-NMR, C^(l3)-NMR 분석에 의해 anomeric carbon과 anomeric proton이 존재하는 것으로 나타났다. 응집제 DP-152의 구성성분과 원소 분석에서는 총당함량은 82.4%, acetic acid 4.27%, pyruvic acid 6.2% 와 32.83%의 uronic acid를 함유하고 있었으며, 원소성분은 C, H, O와 N가 각각 38.75%, 6.65%, 43.73%와 0.63%의 비율로 함유하고 있었다.
응집제 DP-152의 gel permeation chromatography에 의한 분자량은 2백만 dalton 이상이었으며, differential scanning calorimeter(DSC)에 의한 열분해 특성 실험에서는 119.70℃에서 열분해가 일어났다. 응집제 DP-152의 점도는 zooglan에 비해 높은 것으로 나타났으며 농도에 관계없이 전단 속도의 증가에 따라 점도가 감소하였고, pH 변화에 안정하였다. 웅집제 DP-152의 응집특성은 kaolin 현탁액을 응집시키는데, 보조응집제로서 Ca^(2+)과 Al^(3+) 이온을 사용했을 때 높은 활성을 보였으며 1 ppm 농도에서 가장 높은 응집활성을 나타내었다. 또한 70℃에서도 높은 응집활성을 보여 열에도 대체로 안정하였다. 각종 폐수(식품, 염색, 도측)에 대한 웅집효과는 약 90%의 부유고형물(SS)제거율과 약 70%의 화학적 산소요구량(COD) 감소율을 보여 높은 응집효과를 나타내었다.
Floc의 크기는 응집제 DP-152 용액을 최종농도 20 ppm으로 조절하여 첨가하였을 때 10~12 mm였고, 이때 탈수효을은 62%였다. 응집제 DP-152의 biosorbent로서의 사용 가능성을 탐색하기 위하여 중금속 흡착실험을 실시한 결과, 웅집제 DP-152의 단위중량당 최대 흡착량은 Cu^(2+)이온, Fe^(2+)이온의 경우 각각 150.34 mg, 238.0 mg이었으나, Cr^(6+)크롬이온에 대해 서는 81.3 mg이었고, Cd^(2+)이온에서는 136.6 mg으로 활성탄에 비하여 상대적으로 높은 흡착력을 나타내었다.
응집제 DP-152의 일반적인 성분을 조사한 결과, 응집제 용액의 pH는 6.74, 점도는 680 cp, 고형물함량은 86.7%였으며, 전하밀도는 -1.78(meq/g)의 이온성을 지닌 음이온성 고분자 응집제로 확인되었다.
이상과 같은 결과에서 Bacillus 속 DP-152가 생산하는 응집제 DP-152는 생분해성이며, 이차적인 환경오염의 우려가 없고, 인체에 해가 없는 생물고분자 응집제로서 실제적용에서 낮은 농도에서도 뛰어난 응집활성을 나타내었다. 응집에 관여하는 성분과 실제 산업폐수에 대한 응집조건을 검토한 결과 기존의 합성고분자 응집제(polyacrylamide)에 비하여 동일이상의 효과를 보였으며, 중금속 흡착에서도 뛰어난 흡작력을 나타내어 실제 폐수 처리공정에서 응집제와 흡착제로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다 실제 폐수처리 공정에 적용하기 위해서는 웅집제를 저럼하게 생산하기 위한 생물공정 기술개발과 값싼 배지의 개발이 병행되어야 할 것으로 사료되며, 또한 각중 페수록성에 따른 다양한 미생물응집제의 개발이 요구되므로 이에 대한 연구가 점진적으로 수행되어야 하겠다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The study was peformed to investigate the excellent microbial flocculant which is more effective than the chemicals in the wastewater treatment. For the screening of the microorganisms, more than 200 bacterial strains which excreted mucous material were isolated from many kinds of soil samples. A typical strain which produced the most excellant flocculating material was selected.
The strain was identified Bacillus sp. through the results of morphological, biochemical and chemotaxonomical characteristics and designated as Becillus sp. DP-152.
For the maximal production of the microbial flocculant from Bacillus sp. DP-152, the optimal culture conditions such as medium composition, temperature and initial pH were investigated. The optimized medium composition was as follows : 30 g soluble starch, 0.75 g NH_(4)NO_(3), 2.0 g K_(2)HPO_(4), 0.1g KH_(2)PO_(4), 0.2 g MgSO_(4)·7H_(2)O, 0.4g MnSO_(4)·4H_(2)O and 0.4 g NaCl in a liter Of distilled Water. Optimal temperature and initial pH were 30℃ and 8.0, respectively. The highest flocculating activity is shown after 50-hour cultivation in a jar fermentor using the optimized medium, and then the viscosity of culture broth and the amount of polysaccharide at this time were 70,000 centipoise and 10 g/l, respectively.
The distribution of flocculating activity of culture broth was examined and major constituent with flocculating activity was identified. Most of flocculating activity was found in culture broth without cells and more than 90% of flocculating activity was recoverecl from ethanol precipitate (flocculant DP-152).
The molecular weight of flocculant DP-152 was estimated over 2,000,000 dalton by gel permeation chromatography. Main sugar of flocculant DP-152 was composed of fucose : galactose : glucose : mannose with a molar ratio of 16: 27: 86: 42. Flocculant DP-152 contained 82.4% as a total sugar, and 4,3% acetic acid, 6.2% pyruvic acid and 32.8% uronic acid were included in total sugar. The elemental ratio was determined to 38.0% carbon, 6.7% hydrogen, 43.7% oxygen, and 0.6% nitrogen.
Instrumental analyses such as IR, ^(1)H-NMR, ^(13)C-NMR and ^(1)H,^(1)H-COSY NMR showed that flocculant BP-152 contained -OH group, C-H group, C=O group, anomeric carbon, and anomeric proton in its molecular structure. The melting point of flocculant DP-152 was 119.7 ℃. The viscosity of flocculant DP-152 decreased in proportion to the shear rate and in the presence of salts such as NaCl and CaC1_(2). It remained stable from pH 5.0 to 12.0, but decreased as temperature increased.
In order to investigate the flocculation condition of Kcaolin clay by flocculant DP-152, the effects of some cations, concentration of flocculant DP-152, pH and temperature were investigated. The addition of Ca^(2+) or Al^(3+)as a co-flocculant highly increased flocculating activity. The highest flocculating activity is shown at a flocculant concentration of 1 ppm. Flocculating activity was stable up to 60℃ but decreased above 70℃.
For the evalution of industrial applicability of flocculant DP-152, flocculating efficiency was examined using industrial wastewater such as food wastewater, slaughter wastewater and dye wastewater. The removal rates of chemical oxygen demand(COD) by flocculant DP-152 against food wastewater, slaughter wastewater and dye wastewater were 70%, 62% and 73%, respectively, The removal rates of suspended solid(SS) by flocculant DP-152 were 50%, 91% and 92%, respectively. In the case of slaughter wasterwater, the floc size was 10~12 mm and dehydration rate was 62% in the presence of 20 ppm of flocculant DP-152.
In order to examine the applicability of flocculant DP-152 as a biosorbent for heavy metal removal, the adsorption activity was tested against several heavy metals. The results showed that the total adsorption amounts of copper, ferrous, chronium and cadmium were 150.34, 238, 81.3 and 136.6 mg/g on the basis of dry weight of flocculant DP-152, respectively.
The general characteristics of flocculant DP-152 were as follows : pH 6.74 (flocculant solution), viscosity 680 cp (0.2%)., 86.4% solid content and -1.78 (meq/g) charge density. From charge density, it was concluded that flocculant DP-152 was an anionic flocculant.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• LIST OF TABLES = ⅶ
• LIST OF FIGURES = ⅸ
• ABSTRACT = xiii
• Ⅰ. 서론 = 1
• 1. 응집제의 종류 = 2
• 1-1. 무기응집제 = 2
• 1-2. 유기응집제 = 5
• 1-3. 생물고분자 응집제 = 7
• 1-3-1. 개요 = 7
• 1-3-2. 생물고분자 응집제의 특징 = 9
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 11
• 1. 사용균주 및 배양방법 = 11
• 1-1. 응집제 생산균주의 분리 및 선별 = 11
• 1-2. 균주의 보존 = 11
• 1-3. 균체량 측정 = 13
• 1-4. 점도 측정 = 13
• 1-5. 응집활성 측정 = 13
• 2. 분리균주의 동정 = 15
• 2-1. 형태 및 배양학적 특성 = 15
• 2-2. 생리학적 특성 = 15
• 2-3. 화학적 특성 = 15
• 2-3-1. Diaminopimelic acid (DAP) isomer 분석 = 16
• 2-3-2. 지방산 분석 = 16
• 2-3-3. Quinone 분석 = 16
• 2-3-4. G+C mole 함량 = 17
• 3. 응집제 생산조건의 검토 = 22
• 3-1. 초발 pH 및 배양온도의 영향 = 22
• 3-2. 탄소원의 영향 = 22
• 3-3. 질소원의 영향 = 23
• 3-4. 무기염류의 영향 = 23
• 4. 응집제 DP-152의 분리정제 = 23
• 4-1. 균체 배양액에서의 응집활성 분포 = 23
• 4-2. 응집성분의 분리정제 = 24
• 5. 응집제 DP-152의 구성성분 = 26
• 5-1. 구성성분 및 원소분석 = 26
• 5-2. Bio-LC에 의한 당조성 분석 = 26
• 5-3. ^(1)H-NMR,^(13)C-NMR과 ^(1)H-^(1)H COSY-NMR 분석 = 26
• 6. 응집제 DP-152의 이화학적 특징 = 27
• 6-1. 분자량 결정 = 27
• 6-2. 적외선 흡수 스펙트럼 = 27
• 6-3. 열분해 특성 = 27
• 6-4. 용해도 = 27
• 7. 응집제 DP-152의 유변학적 특성 = 28
• 7-1. 전단속도에 따른 점도 = 28
• 7-2. pH 변화에 따른 점도 = 28
• 7-3. 온도 변화에 따른 점도 = 28
• 7-4. 염농도 변화에 따른 점도 = 28
• 8. 응집제 DP-152의 응집특성 = 29
• 8-1. 양이온의 영향 = 29
• 8-2. 응집제 농도의 영향 = 29
• 8-3. pH의 영향 = 29
• 8-4. 열 안정성 = 29
• 9. 산업폐수에 대한 응집시험 = 30
• 9-1. Jar test를 통한 응집효과 측정 = 30
• 9-2. 화학적 산소요구량 측정 = 30
• 9-3. 탈수효율 측정 = 31
• 9-3-1. 원심탈수기에 의한 탈수효율 측정 = 31
• 9-3-2. 한외여과장치를 이용한 탈수효율 측정 = 31
• 10. 중금속 흡착실험 = 33
• 11. 응집제 DP-152의 성분시험 및 비교 = 35
• 11-1. 전하밀도 측정 = 35
• 11-2. 건조감량 측정 = 37
• 11-3. 외관비중 측정 = 37
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 38
• 1. 응집제 생산균주 선별 = 38
• 2. 분리균주의 동정 = 38
• 2-1. 형태 및 배양학적 특성 = 38
• 2-2. 생리학적 특성 = 42
• 2-3. 화학적 특성 = 45
• 2-3-1. 세포벽의 diaminopimelic acid isomer의 분석 = 45
• 2-3-2. 지방산 분석 = 45
• 2-3-3. Quinone 분석 = 45
• 2-3-4. G+C mole 함량 = 49
• 3. 응집제 생산조건 검토 = 50
• 3-1. 초발 pH의 영향 = 50
• 3-2. 배양온도의 영향 = 50
• 3-3. 탄소원의 영향 = 53
• 3-4. 무기질소원의 영향 = 53
• 3-5. 유기질소원의 영향 = 55
• 3-6. 무기염류 = 56
• 3-6-2. 무기염류의 영향 = 56
• 3-6-2. MgSO_(4)ㆍ7H_(2)O의 영향 = 57
• 3-6-3. K_(2)HPO_(4), KH_(2)PO_(4)의 영향 = 61
• 3-7. C/N ratio 영향 = 64
• 3-8. Fermentor 배양 = 67
• 4. 응집제 DP-152의 분리정제 = 69
• 4-1. 균체배양액에서의 응집활성분포 = 69
• 4-2. 분리정제 = 69
• 5. 응집제 DP-152의 구성성분 = 72
• 5-1. 구성성분 및 원소분석 = 72
• 5-2. Bio-LC에 의한 성분분석 = 73
• 5-3. ^(1)H-NMR, ^(13)C-NMR과 ^(1)H, ^(1)H-COSY NMR 분석 = 76
• 6. 응집제 DP-152의 이화학적 특성 = 80
• 6-1. 응집제 DP-152의 분자량 결정 = 80
• 6-2. 적외선 흡수 스펙트럼 = 82
• 6-3. 응집제 DP-152의 열분해 특성 = 82
• 6-4. 용해도 = 85
• 7. 응집제 DP-152의 유변학적 특성 = 86
• 7-1. 전단속도에 따른 점도 변화 = 86
• 7-2. pH의 영향 = 87
• 7-3. 온도의 영향 = 90
• 7-4. 염농도에 의한 영향 = 90
• 7-4-1. NaCl와 CaCl_(2)의 영향 = 90
• 8. 응집제 DP-152의 응집 특성 = 94
• 8-1. 양이온의 영향 = 94
• 8-2. 응집제 농도의 영향 = 97
• 8-3. pH의 영향 = 97
• 8-4. 열 안정성 = 101
• 9. 각종 산업 폐수에 대한 응집 = 103
• 9-1. 식품폐수에 대한 응집효과 = 103
• 9-1-1. pH의 영향 = 103
• 9-1-2. 농도의 영향 = 105
• 9-2. 도축폐수에 디한 응집효과 = 107
• 9-2-1. pH의 영향 = 107
• 9-2-2. 농도의 영향 = 107
• 9-3. 염색폐수에 대한 응집효과 = 110
• 9-3-1. PH의 영향 = 110
• 9-3-2. 농도의 영향 = 110
• 9-4. 합성고분자 응집제와의 응집효과 비교 = 113
• 9-5. 응집제 농도에 따른 floc 크기 = 116
• 9-6. 탈수효과 = 116
• 9-6-1. Floc의 크기에 따른 탈수효율 = 116
• 9-6-2. 자연한계에서의 탈수율 = 119
• 10. 중금속 흡착 = 123
• 10-1. 구리이온 흡착 = 123
• 10-2. 철이온 흡착 = 124
• 10-3. 크롬이온 흡착 = 124
• 10-4. 카드뮴 흡착 = 124
• 11. 응집제 DP-152의 성분시험 및 비교 = 130
• Ⅳ. 요약 = 132
• Ⅳ. 참고문헌 = 135