Monitoring of T-2 and HT-2 Toxins in Cereals Using a Laboratory Validated, Simultaneous HPLC Detection Method

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fusarium species are known as common contaminants of foods and feeds; they are responsible for the production of tricothecene mycotoxins. F. sporotrichoides, F. accuminatum and F. poae produce harmful T-2 and HT-2 toxins in cereals. This study established and validated a high performance liquid chromatography method for simultaneous detection of T-2 and HT-2 toxins, and the method was then used for monitoring of these mycotoxins in cereals. Immunoaffinity columns were used for sample purification and the purified toxins were derivatized with 1-Anthroylcyanide (1-AN) in presence of 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) prior to HPLC coupled with FLD analysis. A binary gradient elution with the initial composition of 70% acetonitrile was gradually ramped to 100% within the chromatographic running time. The method was established using T-2 and HT-2 reference standards and spiked cereal samples. Results showed that, Phenyl Hexyl Luna column at 40℃ had a better sensitivity using toluene as a derivatization solvent with the molar ratio of 300 and 325 ㎍/ml of 1-AN and 4-DMAP respectively. Linearity (R2) of the standard curves were 0.9992 and 0.9979 for T-2 and HT-2 toxins respectively. Accuracy of the detection method (62 to 110%) for T-2 and (67 to 118%) for HT-2 were within the acceptable range (60 to 130%). Precisions ranged from 0.63 to 3.87 for T-2 toxin and 0.09 to 6.57 for HT-2 toxin. LOD and LOQ were 8 ng/g and 10 ng/g for T-2 and 6 ng/g and 8 ng/g for HT-2 toxins, respectively. The analytical range was 8 to 2000 ng/g for T-2 toxin and 6 to 2000 ng/g for HT-2 toxin. 75 cereal samples were monitored for the natural occurrence of T-2 and HT-2 toxins. Out of which 13 and 25 samples were found to be contaminated with T-2 and HT-2 toxins respectively, 4 samples were found to be contaminated with both toxins. This study provide not only a simultaneous detection method for the T-2 and HT-2 toxins in cereals but also the status of T-2 and HT-2 toxins in cereals in Gyongnam province, South Korea.

국문 초록 (Abstract)

T-2, HT-2 독소는F. sporotrichoides, F. accuminatum 그리고 F. poae 곰팡이들이 생성하는 독소로, 식품과 사료에 존재하며 인간과 동물에게 위해를 가한다. 곡류에서 T-2와 HT-2 독소를 검출하기 위하여 본 연구는 형광검출기를 장착한 고속 액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography; HPLC)와 면역친화성컬럼 (Immunoaffinity column)을 통한 정제, 그리고 형광표지물질인1-Anthroylcyanide (1-AN)와 4-dimethylaminopyridine(4-DMAP)을 이용하여 검출방법을 확립하고 검증하였다. 덧붙여, T-2와 HT-2 독소의 자연적인 오염현황을 확인하기 위하여 75 종류의 곡류 시료를 선택하여 모니터링을 실시하였다. 유도체 과정에서 반응에 민감한 유도체 용매를 선택하기 위해 toluene과 acetonitrile을 시험하였고, 유도체화에 적합한 비율을 선택하기 위하여 1-AN과 4-DMAP의 비율을 달리하여 가장 민감하게 반응하는 비율을 선택하였다. HPLC 컬럼 조건을 선택하기 위하여, 다른 농도의 독소에 1-AN과 4-DMAP를 유도체화 하고, Waters Symmetry C18와 Phenyl Hexyl Luna column 컬럼을 각각 30, 40 그리고 45℃로 온도조건을 달리하여 HPLC에 주입하는 실험을 3회 반복 실시하여 피크를 비교하여 적합한 컬럼과 온도를 선택하였다. 이동상 용매는 두 용매를 이용하였는데, 처음은 70% acetonitrile로 시작하여 서서히 100% acetonitrile로 비율을 높여 사용한다. 검증을 위하여, 보리, 쌀, 옥수수 그리고 검은콩 시료에 인위적으로 T-2와 HT-2 독소를 100, 200 그리고 500 ng/g으로 오염시켜 NaCl과 80% MeOH로 추출하고, 면역친화성컬럼을 통해 정제하고 정밀성, 정확성과 분석 범위를 평가하였다. 특이성, 검출한계, 정량한계는 T-2, HT-2 독소를 인위적으로 오염시킨 시료의 크로마토그램을 통해서 결정하였다. 또한 표준곡선(6, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/g) 의 직선성을 평가하였다. Phenyl Hexyl Luna column은 40℃에서 유도체용매로 toluene을 이용하면서 1-AN과 4-DMAP의 농도 비율이 각각 300, 325 ㎍/ml일 때 가장 민감한 것으로 보였다. 직선성을 평가하기 위한 상관관계 계수는 T-2는 0.9978, HT-2는 0.9998로 확인되었다. 검출 방법 중 정확성은 T-2 독소는 62-110%, HT-2 독소는 67-118%, 분석범위는 60-120%로 확인되었다. 정밀성 범위로 T-2 독소는 0.63-3.87, HT-2 독소는 0.09-6.57%로 나타났다. 검출한계와 정량한계는 각각 8 ng/g, 10 ng/g, T-2 독소는 6 ng/g, HT-2 독소는 8 ng/g로 확인되었다. 75 종류의 곡류 시료 분석에서 T-2와 HT-2 각각의 독소에 오염된 13종류, 25종류의 시료를 확인하였으며, T-2, HT-2 독소에 동시에 오염되어 있는 시료 4종류를 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 8
• 1.0. Materials 8
• 1.1. Chemicals and Materials 8
• 1.2. Apparatus 8
• 2.0. Methods 9
• 2.1. Preparation of standard and reagent solutions 9
• 2.2. Optimization of the derivatization parameters 9
• 2.2.1. Analytical column and column temperature 9
• 2.2.2. Organic chemicals for derivatization 10
• 2.2.3. Stoichiometric ratios (derivatization molar ratio) 10
• 2.3. Sample preparation 10
• 2.4. Derivatization procedures 12
• 2.5. HPLC determination 13
• 2.6. Validation of an analytical method 14
• 2.6.1. Specificity 14
• 2.6.2. Linearity 15
• 2.6.3. Accuracy 15
• 2.6.4. Precision 16
• 2.6.5. Range 16
• 2.6.6. Limits of detection 17
• 2.6.7. Limits of quantification 17
• 2.7. Monitoring of the occurrence of T-2 and HT-2 toxins in cereals 17
• 2.8. Measurement of T-2 and HT-2 toxins in cereals 19
• III. RESULTS AND DISCUSSION 20
• 1.0. Optimization of derivatization and analytical parameters 21
• 1.1. Organic solvent for derivatization 21
• 1.2. Stoichiometric ratios (derivatization molar ratio) 24
• 1.3. Analytical column and column temperature 27
• 1.4. Sample preparation 31
• 1.5. Derivatization and HPLC determination 31
• 2.0. Validation of the analytical method 32
• 2.1. Specificity 32
• 2.2. Linearity 37
• 2.3. Accuracy 38
• 2.4. Precision 39
• 2.5. Range 43
• 2.6. Limits of detection 43
• 2.7. Limits of quantification 46
• 3.1. Monitoring of the occurrence of T-2 and HT-2 toxins in cereals 49
• IV. CONCLUSIONS 56
• V. REFERENCES 58