애기장대 TGS29에 의해 조절되는 브라시노스테로이드와 TGS29 스트레스 반응 = Regulation of Brassinosteroid and Stress Responses by TGS29 in Arabidopsis thaliana

국문 초록 (Abstract)

식물의 스테로이드 호르몬인 브라시노스테로이드(Brassinosteroid, BR)는 식물의 생장 및 발달을 조절하는 중요한 역할을 한다. BR 신호전달 과정의 억제성 조절자인 BIN2는 다양한 단백질과 상호작용하며 신호전달 및 발달 과정을 조절한다. 기존 연구에서 TurboID 기반의 BIN2 인터액톰 연구를 통해 BIN2와 상호작용 가능한 단백질들이 확인되었으며, 그중 기능이 밝혀지지 않은 RLCK V 계열 단백질인 TGS29가 포함되어 있음을 발견하였다. 그러나 이들의 실제 상호작용 여부는 구체적으로 확인되지 않았다. 본 연구에서는 BIN2와 TGS29의 상호작용 및 BR 신호전달과의 관계를 규명하고자 하였다. BiFC, CoIP를 통해 TGS29와 BIN2의 상호작용을 확인하였으며, kinase assay를 통해 TGS29가 BIN2에 의해 인산화 될 수 있음을 밝혔다. 또한 TGS29 과발현 시킨 돌연변이 식물을 제작하여 dwarfism의 표현형을 관찰했으며, 생체 내에서 BIN2 억제제인 bikinin에 대한 낮은 반응성을 확인했다. 이 때, bikinin 처리에 따라 TGS29 단백질의 축적이 발생하는 것을 관찰하였다. 나아가 RLCKs인 TGS29는 BIN2뿐 만 아니라, 세포막에 존재하는 BR 수용체인 BRI1과도 상호작용한다. kinase assay를 통해 TGS29가 BRI1에 의해 인산화 될 수 있으며, 인산화 자리를 규명하기 위해 LC-MS/MS를 통해 분석하였다. 그러나 이러한 상호작용이 가능함에도, bri1-301 돌연변이에 TGS29를 과발현 시켜도 여전히 dwarfism을 보이며 bikinin에 대한 낮은 반응성을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 최종적으로 TGS29의 기능을 규명하기 위해, RNA-Seq 분석을 진행했고 그 결과로 TGS29가 과발현된 돌연변이 애기장대에서 BR 반응과 관련된 유전자 이외에 스트레스 조절 유전자가 크게 변화하는 양상을 보였다. TGS29는 에틸렌, 자스몬산 등 스트레스 반응 관련 유전자 발현을 크게 증가시키며, TGS29 과발현체에서 스트레스 반응에 의해 형성되는 안토시아닌 함량이 최대 12배 높아져 있음이 발견되었다. 이상의 결과를 종합하여, 본 연구는 RLCK V 그룹의 TGS29가 BIN2와 BRI1과의 상호작용을 통해 BR 신호전달과 스트레스 반응을 조절하는 새로운 매개체임을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• 목차 i
• List of Figures iv
• List of Tables vi
• 국문초록 vii
• 제 1장 서론. 1
• 1. 브라시노스테로이드 (BR) 신호전달경로와 생리적 기능 1
• 2. Receptor Like Cytosolic Kinases (RLCKs)의 분류와 기능 7
• 제 2장 실험 재료 및 방법 13
• 1. 식물 재료와 생육 13
• 2. Plasmid construction 14
• 3. Agrobacterium을 통한 식물체로의 형질전환 16
• 1) 형질전환체 제작 16
• 2) 형질전환체 선별 16
• ii
• 4. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay 17
• 5. Co-immunoprecipitation (Co-IP) 17
• 6. Immunoblotting 18
• 7. In vitro Kinase Assay 18
• 1) 단백질 정제 18
• 2) in vitro Kinase Assay 19
• 8. LC-MS/MS Analysis 20
• 1) in vitro Kinase Assay 20
• 2) Mass Spectrum 분석 20
• 9. RNA-Seq Analysis 21
• 10. RT-qPCR 분석 21
• 11. 안토시아닌 농도 측정 23
• 제 3장 결과 24
• 1. TGS29의 세포 내 위치 및 in vivo 상에서의 BIN2와의 결합 확인 24
• iii
• 2. in vitro에서의 BIN2에 의한 TGS29의 인산화 확인 28
• 3. TGS29 과발현 애기장대에서의 BR 반응성 확인 34
• 4. BRI1에의해 인산화 되는 TGS29 39
• 5. TGS29 과발현에 따른 bri1-301의 표현형 변화 42
• 6. RNA-Seq을 통한 TGS29와 BR의 유전자 조절 양상 분석 44
• 7. BR과 TGS29가 공동으로 조절하는 유전자 양상 확인 50
• 8. TGS29 특이적으로 조절되는 스트레스 반응 양상 분석 52
• 제 4장. 결론 및 고찰 61
• Reference 68
• Appendix 74
• Abstract 84
• Acknowledgment 86
• iv