고위험 병원체의 고감도 탐지 및 진단 신기술 개발, 2007 = A novel diagnostic technology with high sensitivity to detect highly biohazard pathogens

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The goal of this study is to develop the rapid microfluidic protein chip to detect highly toxic bioterror pathogens of Francisella tularensis, Brucella abortus, Yersinia pestis, Vaccinia virus, Bacillus anthrax. Vibrio cholerae, Ricin, Staph enterotoxin B, Botulinum toxin. This kit is devised to use on-site or in the working field with a portable fluorescence detector. The microfluidic protein chip is an integrated microchannel network containing all necessary components such as sample application area, surface fluidic microchannels of stepwise reaction chambers, reaction controlling mechanics and detection sensor that are required to detect the fluoresence sensor signal. The major technologies involved for this goal can be divided into 4 groups； development of content, device, detector and microfluidic protein chip. 1) Contents development： Each antibody of nine kinds of toxic pathogens was developed, the fluorescence tracer was synthesized to develop antibody-fluorescence conjugate which is utilized as a sensor signal for a detector. 2) Device development- A plastic microfluidic device was designed based on the simulation study of reagent flow on the surface microchannel. The final mold design was selected by optimization studies of mold size, mold construction, injection and ejection molding methods, gate types, resins used. A batch of mass production was carried out using a optimized mold 3) Development of the sensor signal detector: To detect fluorescence signaJ of phthalocyanine coryugate, a fluorescence detector was developed for the proportional detection of signal against fluorescence concentration building with the laser diode and photodiode. 4) Development of the microfluidic protein chip technology： A plateform of the protein chip was developed for the one-step measurement of highly toxic bioterror chemicals with high detection sensitivity. The optimized technologies involved s microchannel construction on a plastic device (solvent or ultrasonic adhesion methods), reagent immobilization on the microchannel network (covalent or adsoption methods), and surface treatment process for smooth reagent flow (O2 plasma or S於2 CVD). Antibodies of eight toxic bioterror chemicals (Francisella Cularensis, Brucella abortus, Yersinia pestis, Vaccinia virus, Bacillus anthrax, Vibrio cholerae, Ricin, Staph, enterotoxin B) were developed and tracers of each antibody-phthalocyanine fluorescence conjugate was synthesized for the microfluidic detection of the corresponding chemicals. A microfluidic chip technology was established by optimizing the technologies such as the total systemic examination of the design, interpretation of fluidic characters, mold construction, injection and adhesion method. Also, a prototype fluoresence detector was constructed that is useful to detect the signal in a range of Infra-red wavelength. When the detection sensitivity of each toxic chemical using the microfluidic system was compared with the existing rapid chromatography system, the results indicate that the sensitivity of microfluidic system (1.25 x 104 、5 x 104cfu/mL) is 2 to 8 times more sensitive than that of rapid chromatography system (105 cfu/mL) for Francisella tularensis, Brucella abortus, Yersinia pesds, Vaccinia vims, Bacillus anthrax and Vibrio cholera and 2 to 4 times more sensitive than that of rapid chromatography system for Staph, enterotoxin B(5 ng/mL), Ricin(lZ5 ng/mL) and Botulinum toxin(125 ng/mL). A palteform of the micrfluidic protein chip was developed successfully to detect highly toxic chemicals, and the effectiveness of the system was validated using nine kinds of bioterror toxic pathogens. Further studies are required to settle the sensitive and reproducible microfluidic protein chip technologies that include generation of stronger sensor signal, synthesis modification of fluorescence conjugate tracer, device construction for better microchannel network to control the reaction steps and construction of a simple and portable detector. M^jor progress to solve above issues will be reported and SD will produce the commercial products of bioterror toxic pathogens using the microfluidic protein chip technology in future.

국문 초록 (Abstract)

마이크로플루이딕스 칩(미세유체역학칩)온 미량의 분석대상 물질을 흘려보내면서 칩에 집적되어있는 각종 생물분자 혹은 센서와 반응하는 양상을 분석할 수 있는 칩을 말한다. 본 연구개발에서 개발코자 하는 기술은 마이크로프루이딕스 칩 기술을 이용하여 소형 및 고감도의 진 단을 구현하는 기술로서 칩 표면에 용액이 흐를 수 있는 미세 채널 네트워크, 생체 시료 적용 및 처리, 반응제어, 검출 둥올 하나의 칩에 집적화시키며 여기에 (형)광학적 검출원리를 이용한 휴대용 검출기기가 결합된 기술이다. 본 연구개발에서는 마이크로플루이딕스 칩과 소형형광측정기률 이용하여 생물학무기로 활용될 수 있 는 다수의 독성물질을 동시에 고감도로 검출할 수 있는 기술을 개발코자 하며 여기서 독성물질온 병원 성 미생물과 단백질 독소를 포함한다 신기술 개발을 위해 필요한 핵심은 크게 4가지로 나눈다. 첫째 컨텐츠 개발，둘째 디바이스 개발, 셋 째 측정기 개발. 넷째 단백질 칩 개발이다. 첫째 컨텐츠 개발에서 고위험 병원체에 대한 각각의 항체들을 개발하였으며 신호발생을 위해 프탈로 시아닌을 합성하였고 여기에 항체를 중합시켜 신호발생원으로 사용하였다. 둘째 디바이스 개발을 위해 디바이스 디자인 설계 및 유동 시물레이션 자료를 기초로 하여 단백질 칩 분석에 가장 최적인 금형을 제작하였다. 이를 이용, 플라스틱올 이용한 사출성형을 실시하여 디바이스를 사출하였다. 셋째 측정기 개발은 프탈로시아닌의 형광신호를 측정하기 위해 레이져 다이오드 및 포토다이오드를 사용하여 프탈로시아닌 농도에 따라 형광신호가 비례적으로 나오도록 제작하였다. 최종적으로 단백질 칩 개발을 위해 컨텐츠의 디바이스 고정화 기술(공유결합 및 흡착》, 디바이스의 마 이크로체널 형성기술(용제접착 및 초음파 융착), 유동올 위한 표면처리 기술(02 plasma 또는 SiCfe CVD)둥을 모두 결합시켜 One-step으로 독성물질올 고감도로 진단할 수 있는 단백질 칩 플랫폼을 개발하였다. 독성물질 8종(야토병, 브루세라, 페스트f 백시니아. 탄저, 콜레라, 리신, SEB)에 대한 항체 개발을 완 료하였으며 이를 이용하여 신호발생원을 중합하였다. 마이크로플루이딕스 칩 디바이스의 총체적 디자인 , 유 동해석 , 몰드구성 , 사출 및 융착 에 대한 제반 기술올 확보하였으며 적외선 파장대롤 이용한 prototype의 형광 판독기가 제작되었다. 상기 기술들을 통해 독성물질올 검출한 결과 야토, 부루셀라， 페스트，백시니아, 탄저，콜레라는 기존 rapid chromatography 시스템의 민감도인 10⁵ cfu/mL 보다 2~ 8배 높은 1.25 x 10⁴^ 5 x io ⁴ cfu/mL을 나타내었으며 SEB는 5 ng/mL, 리신은 12.5 ng/mL, 보틀리 눔은 12.5 ng/mL로 기존 rapid chromatography 시스템 민감도 보다 2?4배 이상의 감도를 나타내었다. 결론적으로 고위험 병원체롤 고감도로 탐지할 수 있는 단백질 칩 플랫폼을 완성하였으며 독성물질 9 종에 대한 시스템의 유효성을 확인하였다. 향후 컨텐츠의 신호발생원 제작 기술, 디바이스 제작기술， 마이크로 체널 형성 기술, 측정기 제작 기술 둥을 수정보완 하여 민감도률 올리고 재현성 있는 신호가 발생할 수 있도록 하여 POCT용 제품화에 주력할 계획이다.