CRBN의 AMPK 활성 조절기전 규명을 통한 항비만 및 항당뇨 제제의 개발 = Discovery of anti-obesity and anti-diabetic drugs based on the molecular mechanism of AMPK regulation by CRBN R&D Report

국문 초록 (Abstract)

연구의 목적 및 내용
정신지체 발병 원인 유전자이며 대사조절의 핵심효소 AMPK의 음성적 활성조절 자로 검증된 cereblon (CRBN)의 1) 활성조절기전을 분자 및 세포수준에서 이해하고, 2) CRBN 유전자 발현 양상 및 조절인자를 확인하며, 3) 인간 CRBN 돌연변이의 분자병인을 규명하고, 4) 조직 특이적 유전자 결손 동물모델의 확보를 통해 CRBN의 AMPK 조절기전 및 효과를 규명함으로써, 향후 CRBN과 AMPK 결합 억제물질 탐색을 통한 비만 및 당뇨 등 대사질환의 새로운 치료 후보물질 을 발굴에 기여함.
연구개발성과
◦ CRBN의 AMPK 활성화 분자기전의 규명
․ AMPK α-소단위체가 CRBN의 N-말단 및 C-말단 도메인에 결합하는 것을 확인하고, 결합에 중요한 단백질 모티프(motif)를 규명함.
․ AMPK γ-소단위체가 프로테오좀(proteasome) 의존적으로 분해를 확인함.
․ AMPK γ-소단위체가 CRBN에 의하여 유비퀴틴화 됨을 확인함으로써, γ-소단위체가 CRBN의 새로운 기질(substrate)임을 규명함.
․ AMPK γ-소단위체의 유비퀴틴화 위치 확인을 위한 돌연변이 단백질을 구축함.
◦ 세포 외부인자에 의한 CRBN 유전자 발현조절 기전 규명
․ 생리학적 농도의 포도당에 의해 CRBN 유전자의 발현 및 단백질의 증가를 확인함.
․ CRBN의 프로모터 상류 부위(upstream)의 전사인자 결합위치를 탐색하고, CRBN
유전자발현 후보 전사인자 표적을 도출함.
◦ 정신지체 발병 CRBN 돌연변이의 분자적 병인 규명
․ AMPK를 통한 CRBN의 하류 표적 mTOR의 활성 증가를 확인함.
․ 돌연변이 CRBN(mutant CRBN)’이 AMPK에 대한 강한 결합력을 상실함을 확인함.
․ 돌연변이 CRBN이 AMPK-mTOR 경로를 통한 새로운 단백질 합성의 조절능을 상실했음을 확인함.
◦ 조직 특이적 CRBN 결손생쥐 구축
․ 간(liver) 특이적 CRBN 결손생쥐의 확보를 위해, LoxP 생쥐와 albumin cre 생쥐를 확보, 유지함.
․ LoxP CRBN과 albumin-cre 생쥐의 교배를 통한 2세대 생쥐를 구축하여 확보함.
연구개발성과의 활용계획(기대효과)
◦ CRBN의 AMPK 활성억제 기전이 AMPK 복합체의 α-소단위체 결합 및 γ-소단위체에 대한 유비퀴틴-프로테아좀 의존적 분해에 의한 함임을 규명함.
◦ CRBN과 AMPK의 결합부위를 특정함으로써, 향후 이 부위 결합의 저해를 통해 AMPK를 지속적으로 활성화하는 항비만 및 항당료 약물개발에 기여함.
◦ CRBN 유전자 발현를 조절하는 외부인자 및 전사조절 인자를 도출함으로써, CRBN 발현의 인위적 조절 가능성을 제시함.
◦ 돌연변이 CRBN에 의해 유도되는 정신지체의 분자병인을 규명함으로써, 조기검진 및 치료법 개발 등의 향후 연구에 기여함.
◦ 간 특이적 CRBN 결손생쥐를 구축함으로써, 생체 에너지 대사 조절 시 간 내 CRBN의 기능 규명이 가능하게 함.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose&Contents
Elucidating the mechanism of the AMPK, which is the master regulator of energy homeostasis and metabolism, regulation by CRBN. To clarify the effect of CRBN-dependent AMPK regulation using tissue-specific knockout strategy in mice. Moreover, deducing materials for metabolic syndromes such as diabetes and obesity would be performed.
Results
◦ Mechanism of CRBN dependent AMPK regulation
․ Confirm the CRBN-AMPK interaction domain using CRBN domain mutants.
- AMPK α binds to N-terminal and C-terminal domain of CRBN
․ Effect of thalidomide on AMPK regulation by CRBN.
- Thalidomide does not affect to AMPK-CRBN interaction
․ Elucidating AMPKγ-Subunit ubiquitination and degradation by CRBN.
․ Set up the Lys-mutant of AMPKγ to investigate the ubiquitination residue
◦ Elucidating the molecular mechanism of CRBN for autosomal recessive nonsyndromic mental retardation
․ The mutant form of CRBN effects to CRBN-AMPK-mTOR cascade : Dysregulation of the protein synthesis
◦ Generation of the Tissue-specific CRBN Knockout mice ․ Setting up wholebody CRBN LoxP-Floxed mice.
․ Generating liver specific knockout mice using AlbCre-LoxP system
․ Half-deleted level of the CRBN in liver was confirmed in hetero and mating for homo generation
◦ Derive the factors for expression and transcriptional regulation of the CRBN.
․ Elevated protein level of CRBN by treating relevant concentration of glucose.
․ Investigate the transcription factor for CRBN promoter region.
Expected Contribution
◦ Elucidating the regulation mechanism of AMPK activation through CRBN-dependent ubiquitination and proteasomal degradation of AMPKγ
◦ Synthesis of the peptide to inhibit the interaction between CRBN N-terminal and AMPKα. And confirm the AMPK activation level.
◦ Investigate the transcription factor for regulation CRBN
◦ Liver-specific CRBN knockout mice genaration and high-fat diet experiment.