바이러스와 세포간 상호작용 분석을 위해 EGFP를 발현하는 마우스 레트로바이러스 제조

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Moloney murine leukemia virus (MoMLV) env 유전자의 PRR (proline rich region) 부분에 Green Fluoresecence Protein (GFP)을 삽입할 경우 wild type MoMLV와 비슷한 수치로 바이러스가 발현을 한다고 보고되었다. 이를 이용하여 두 가지 실험을 시행하였다.
첫째, MoMLV와 env유전자의 82번째 아미노산이 치환되어 wild type과는 달리 합포체 (syncytium)를 일으키는 MoMLV (S82F)의 PRR 부분에 GFP를 삽입하여 GFP가 지속적으로 발현하는 GFP-env chimeric 마우스 레트로바이러스인 pBR322.2+GFP를 만들어 주었고, 마우스 레트로바이러스의 수용체인 dCAT-1을 발현하는 인간 세포주에 감염시켜 합포체가 형성되는 것을 확인하였다. 또한 S82F가 pseudotype assay를 통하여 m-CAT이 발현하는 NIH3T3 세포주에서는 감염되지 않고, d-CAT이 발현하는 M. dunni 세포주에서는 감염된다고 보고되었다. Replication competent virus인 pBR322.2+GFP를 NIH3T3 세포주에 감염시킨 결과, GFP가 발현하지 않는 것을 확인하였고, 이 바이러스가 NIH3T3 세포 주에 감염 될 수 없는 것을 알 수 있었다.
둘째, gag 유전자의 110번,114번째의 아미노산을 제거한 AKV는 바이러스의 restriction factor인 Fv1에 대하여 감수성이 있다고 보고되었다. 두 가지 아미노산이 제거된 AKV gag 유전자를 chimeric 마우스 레트로바이러스인 MoMLV+GFP, MoMLV (S82F)+GFP의 gag 유전자와 치환시켜 Fv1을 발현하는 마우스 세포주에 감염 후, GFP를 통해 저항여부를 관찰하였다. 감염 결과, gag 유전자가 치환된 MoMLV+GFP는 Fv1에 대하여 저항성이 있는 것을 GFP의 발현을 통해 확인할 수 있었다. 자세한 기작에 대해선 알 수 없었고, Gag 유전자 외에도 여러 가지 다른 요인에 의하여 tropism이 결정될 수 있다고 예상하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Sequences encoding the GFP were inserted into the Env of Molony murine leukaemia virus. Insertion of these sequences into the proline-rich region (PRR) of Env resulted in GFP-Env protein that allowed retrovirus vector transduction of murine cells with titres similar to wild-type Env. Mutagenesis of Molony murine leukemia virus demonstrated that syncytium formation could be attributed to a single amino acid substitution within VRA, S82F. Sequences encoding the GFP were inserted into the Env of mutant moloney murine leukaemia virus(S82F); pBR322.2+GFP. I have observe that these virus induce cell to cell fusion in ecotropic murine leukemia virus receptor (dCAT-1) expressed 293 human cell lines.
The Fv1 gene inhibits murine leukemia virus infection in mice, but the mechanism of Fv1-mediated restriction is poorly understood. The previous studies had demonstrated that Fv1-mediated viral tropism can be determined within the capsid protein at position 110 and 114(NN). The gag gene of M+GFP, 2+GFP is replaced gag gene of AKV(NN); M+GFP-NN, 2+GFP-NN. The constructions are infected NIH3T3 cell line. The result indicated that substitution of amino acids in MLV replicate in Fv1-expressing cells. This mutant virus would be useful for studying the mechanism of Fv1-mediated restriction.

목차 (Table of Contents)

• 서론 = 1
• 재료 및 방법 = 4
• 1. 세포주및 세포배양 = 4
• 2. 클로닝 = 5
• (1) pBR322.M+GFP = 5
• (2) pBR322.2+GFP = 5
• (3) pBR322.M+GFP-NN, pBR322.2+GFP-NN = 6
• 3. Transfection = 6
• 4. Infection = 6
• 5. RT-PCR = 7
• 6. Confocal Laser Scanning microscopy Analysis = 7
• 7. FACS Analysis = 8
• 결과 = 15
• 1. 돌연변이 Molony murine leukemia virus의 제조 = 15
• 2. NIH3T3 세포주에서 지속적으로 발현하는 pBR322.M+GFP = 18
• 3. pBR322.2+GFP에 의한 세포융합 = 22
• 4. 세포내의 restriction factor 에 대한 pBR322.M+GFP-NN과 pBR322.M+GFP 의 저항성 연구 = 24
• 고찰 = 28
• 참고문헌 = 32
• List of Figures = 36
• (Abstract) = 38