혈소판활성인자에 의한 혈관형성과 세포사멸에 있어서 NF-kappaB 의존적 분자기작

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Angiogenesis plays a key role in tumor growth, invasion, and metastasis. The mechanisms of increased tumor cell survival and decreased tumor cell apoptosis relate with angiogenesis. In this study, the molecular mechanisms for nuclear factor (NF)-κB dependency in platelet-activating factor (PAF)-mediated angiogenesis and apoptosis are investigated. First, the involvement of PAF-dependent NF-κB activation pathway in mouse macrophage-induced angiogenesis was investigated. Mouse peritoneal macrophage-induced angiogenesis in a Matrigel implantation in vivo, which was inhibited by PAF antagonists or NF-κB inhibitors. The critical role for NF-κB activity in macrophage-induced angiogenesis implies that specific angiogenic molecules regulated by NF-κB are involved in the process. PAF antagonist or NF-κB inhibitors suppressed the expression macrophage-derived NF-κB-dependent angiogenic factors, such as interleukin (IL)-1, tumor necrosis factor (TNF)-α, and vascular endothelial growth factor (VEGF). PAF antagonist or NF-κB inhibitors also, suppressed the expression of macrophage-derived NF-κB-dependent angiogenic factors and inhibit the human macrophage-derived angiogenesis. These results suggest that PAF-induced NF-κB activation is a critical upstream pathway in macrophage-induced angiogenesis. Second, the possibility that NF-κB and p53 transcriptionally cross-regulate each other's activity in VEGF expression by PAF was investigated. NF-κB subunits (p65/p50) increased the TNF luciferase activity and the increase was completely inhibited by wild type, but not mutated type, p53. Likewise, the p53-mediated increase in p53RE-reporter luciferase activity was completely inhibited by NF-κB subunits. PAF induced NF-κB activation in endothelial cell ECV 304. However PAF-induced NF-κB activation did not occur in p53-transfected ECV 304 cells. Treatment of MCF-7 cells overexpressing p53 with PAF resulted in no NF-κB activation, whereas strong NF-κB activation occurred in DLD-1 cells with no p53 activity due to p53 mutation. Furthermore, PAF-induced degradation of IκBα and p53 were observed to a similar kinetics. Parallel to VEGF luciferase activity, mRNA expression of VEGF was similarly regulated by PAF or wild type p53. These data suggest that PAF-induced increase in VEGF expression is due to decreased p53 activity which is reciprocally regulated by NF-κB activity. However, 5'-deletion and transient transfection and analysis showed that NF-κB and p53 exert their activity through regulating the transcription factors which bind to different binding site of VEGF promoter, sugessting an existence of NF-κB-independent pathway in p53-mediated regulation of VEGF expression. Third, the role of PAF in apoptosis was investigated. PAF enhanced anti-apototic factor gene expression and protein synthesis in mouse melanoma B16F10 cells and in vivo tumor model. PAF inhibited etoposide-induced DNA fragmentation and caspase-3 activation. PAF induced NF-κB activation in B16F10 cells and NF-κB inhibitor blocked PAF-induced anti-angiogenic factor gene expression and protein synthesis. Also, NF-κB inhibitor diminished the protective effect of PAF on etoposide-induced DNA fragmentation and caspase-3 activation. These data suggest that PAF protects against etoposide-induced apoptosis through NF-κB activation. These data indicate that i) PAF induces angiogenesis through NF-κB-dependent angiogenic factor expression in macrophage-induced angiogenesis, ii) PAF regulates VEGF expression through cross-talk of NF-κB and p53, iii) PAF inhibits etoposide-induced apoptosis through NF-κB activation. Thus, PAF appears to augment tumor growth and metastasis via enhancement of angiogenesis and suppression of apoptosis through the NF-κB-dependent pathway. This will provide an important clue for better understanding for the mechanism of tumor metastasis and growth.

국문 초록 (Abstract)

혈관형성은 종양의 증식과 전이에 필수적이며, 종양세포의 생존 및 사멸에도 중요한 역할을 담당한다. 본 연구에서는 혈소판활성인자에 의해 매개되는 혈관형성과 세포사멸에 있어서 NF-κB-의존적 분자기작을 조사하였다. 먼저, 대식세포에 의해 유도되는 혈관형성에 있어서 혈소판활성인자-의존적인 NF-κB 활성 경로의 관련성을 실험하였다. Matrigel 이식 모델을 통한 in vivo 혈관형성실험에서 생쥐 대식세포에 의해 유도되어진 혈관형성능과 IL-1, TNF-α, VEGF와 같은 대식세포유래 혈관형성인자들의 발현이 혈소판활성인자 길항제와 NF-κB 저해제에 의해 억제되었으며, 혈관형성인자들의 중화항체에 의해 대식세포에 의한 혈관형성이 저해되었다. 또한 분지형성을 이용한 in vitro 혈관형성실험에서 사람 대식세포에 의한 혈관형성능과 혈관형성인자들의 발현이 혈소판활성인자 길항제와 NF-κB 저해제에 의해 억제되었다. 이러한 성적은 대식세포 유래 혈관형성에 있어서 VEGF가 주요한 혈관형성인자이며, 혈소판활성인자에 의한 NF-κB 활성화가 주요한 경로임을 시사한다. 다음으로, 혈소판활성인자에 의한 VEGF 발현에 있어서 NF-κB와 p53의 상호전사조절 가능성을 실험하였다. TNF-α promoter의 활성은 NF-κB subunits (p65/p50)에 의해 증가되고, p53에 의해 억제되었으며, 반대로 p53에 의해 증가된 p53RE의 활성은 p65/p50에 의해 저해되었다. 또한 p53 유전자삽입 ECV 304 세포와 p53 과발현 세포주인 MCF-7 세포에서 NF-κB 활성이 혈소판활성인자에 의해 억제되어, 혈소판활성인자에 의한 VEGF 발현 증가 시 NF-κB와 p53 전사인자간의 상호억제조절이 존재함을 알 수 있었다. 그러나 VEGF promoter의 5‘-삭제 실험결과 NF-κB와 p53이 서로 다른 결합부위에 작용함을 확인하였다. 이러한 성적은 혈소판활성인자에 의한 VEGF 발현 시 p53의 전사활성억제는 NF-κB 비의존적 조절임을 시사한다. 마지막으로, 종양세포사멸에 있어서 혈소판활성인자의 역할을 실험하였다. 혈소판활성인자는 생쥐 흑색종 B16F10 및 in vivo 종양모델에서 Bcl-2, Bcl-xL, IAP와 같은 세포사멸 저해분자들의 발현을 증가시켰으며, etoposide에 의한 DNA 분절과 caspase-3 활성을 억제하였다. 세포사멸에 관련된 인자들의 발현과 NF-κB의 관련성을 실험한 결과, 혈소판활성인자는 B16F10에서 NF-κB를 활성화시켰고, 세포사멸 억제인자의 발현 및 조절인자인 Bcl-2/Bax heterodimerization이 NF-κB 억제제에 의해 감소되었다. 또한 혈소판활성인자에 의해 억제되었던 DNA 분절과 caspase-3 활성화는 역시 NF-κB 억제제에 의해 증가됨을 확인하였다. 이러한 성적은 혈소판활성인자가 NF-κB 활성화를 통해 세포사멸 저해인자의 발현과 Bcl-2/Bax heterodimerization의 증가를 유도함으로서 세포사멸을 억제함을 시사한다. 이상의 결과들을 종합해보면, i) 혈소판활성인자에 의한 NF-κB 활성화는 대식세포에서 혈관형성인자들의 발현을 통해 혈관형성을 유도하며, ii) 혈소판활성인자는 NF-κB와 p53의 상호조절에 의해 주요 혈관형성인자인 VEGF의 발현을 유도하고, iii) 혈소판활성인자는 NF-κB 활성화를 통해 etoposide에 의해 유도된 세포사멸을 억제한다는 것을 알 수 있었다. 즉 , 혈소판활성인자가 NF-κB 활성화를 통해 종양전이와 증식의 주요 기전인 혈관형성증가와 세포사멸억제를 유도함을 확인하였다. 이러한 성적은 종양전이와 증식의 조절 기전에 대한 기작 이해와 종양치료에 도움이 될 것이다.