항결핵제의 혈중 약물 농도 측정법 개발 및 임상적 적용(1차년도) = Development of analytical method for the determination of plasma concentration of anti-tuberculosis agents and its clinical application

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

An HPLC/MS/MS method for the simultaneous quantitation of 20 tuberculosis (TB) drugs for the treatment of multi-resistant TB was developed in human plasma. This method will be the first step to propose TDM-guided therapeutic guideline optimized for Koreans. Analytical concentration ranges of the TB drugs were determined based on pharmacokinetic parameter available on published papers. The calibration ranges were 0.04-2.0 μg/ml for rifabutin, 0.10-5.0 μg/ml for ciprofloxacin, clofazimine, and ethionamide, 0.20-10.0 μg/ml for clarithromycin, ethambutol, isoniazid, moxifloxacin, ofloxacin, prothionamide, and rifampin, 0.40-20.0 μg/ml for amoxicillin, cycloserin, linezolid, and roxithromycin, 1.0-50 μg/ml for amikacin, kanamycin, PAS(p-aminosalicylic acid), and streptomycin, and 2.0-100 μg/ml for pyrazinamide. LC/MS/MS system consisted of Agilent LC (1100 series) coupled with API4000 mass spectrometer (Applied Biosystem). Due to physico-chemical diversity, 20 TB drugs were extracted from plasma by two different approach; three group 1 drugs 20 (streptomycin, kanamycin, amikacin) were extracted by adding 300 μl methanol containing 0.13 N HCl to 100 μl plasma and group 2 drugs were extracted by adding 180 μl acetonitrile to 20 μl plasma. Mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution (A) and acetonitrile containing 0.1% formic acid. The LC columns used were an Atlantis C column for group 1 drugs and an Atlantis Hilic Silica column for group 2 drugs. Detection was carried out in selected reaction monitoring (SRM) mode. The calibration curves were linear over a 50-fold concentration range, with correlation coefficients (r ) greater than 0.99 for all TB drugs. The intra- and inter-day precision was less than15%, and the accuracy was between 85.9 and 114.5%. This method was successfully applied to the identification and quantitation of TB drugs in multi-resistant patients undergoingpoly-therapy for TB.

국문 초록 (Abstract)

다제 내성 환자의 치료에 사용되는 2차 항 결핵제의 한국인에서의 유효 약물 농도를 설정하고, 환자의 혈중 약물 농도를 모니터링하여 부작용을 감소하고 치료 효과를 최적화하기 위한 첫 단계로서 human 혈장에서 20종의 1,2차 항결핵제를 동시 분석하는 LC/MS/MS방법을 확립하였다. 항결핵제의 분석 농도는 문헌상의 최대 약물 농도를 근거로 하여 rifabutin는 0.04-2.0 μg/ml, ciprofloxacin, clofazimine, 그리고 ethionamide는 0.10-5.0 μg/ml, clarithromycin, ethambutol, isoniazid, moxifloxacin, ofloxacin, prothionamide, 그리고 rifampin은 0.20-10.0 μg/ml,amoxicillin, cycloserin, linezolid, 그리고 roxithromycin은 0.40-20.0 μg/ml, amikacin, kanamycin, PAS(p-aminosalicylic acid), 그리고 streptomycin은 1.0-50 μg/ml, pyrazinamide는 2.0-100 μg/ml 농도 범위를 설정하였다. 분 시험에 사용한 LC/MS는 Agilent LC (1100 series)와 API4000 질량 분석기 (APPlied Biosystem)를 사용하였다. 20 종의 항결핵제의 화학적 성질의 다양성으로 인해 2가지 추출법으로 나뉘어 개발하였으며, 3종의 group 1 약물(streptomycin, kanamycin, amikacin)은 혈장 100 μl 에 0.13 N HCl을 포함한 300 μl 의 메탄올을 가하여 추출하였고, 나머지 약물(group 2)은 20 μl 혈장에 180 μl 아세토나이트릴을 가하는 단백질 침전법으로 추출하였다. 이동상은 0.1% formic acid를 함유한 물과 acetonitrile을 사용하였고, column은 group 1 약물은 Atlantis C column을 그리고 group 2 약물은 Atlantis Hilic Silica column을 사용하였으며, peak 는 positive ion mode에서 MRM 방법을 이용하여 검출하였다. 확립된 분석 방법은 정량 범위내에서 우수한 직선성과, 재현성을 보여주었으며, 일내와 일간 정확성과 정밀성은 모두 15% 이내로 판명되었다. 본 연구에서 확립된 분석 방법은 치료 중에 있는 다제내성 환자로부터 채취된 혈장 의 분석에 성공적으로 적용되어 추후 임상 연구에 적용할 수 있음을 검증하였다.