한국형 삼일열말라리아 퇴치를 위한 원충 및 매개모기의 생물전략적 실용화 연구 = Biological strategies against Plasmodium vivax malaria and vector control in Korea

국문 초록 (Abstract)

론 감마의 분비량 증가, 항원 특이적 세포독성 반응을 이끌어냄이 확인되었다. 골수 유래 수지상 세포는 항원을 제시해 주는 세포로 말라리아 항원에 대한 특이적 면역 반응을 유도하는데 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다. 삼일열말라리아 단백질문해효소의 발굴 및 특성 분석을 동하여 국내외 유행주에서 약재내성 유전자 분석 및 단백질운해효소의 유전적 변이도 조사 및 말라리아 치료제로 시스테인 단백질문해효소 억제인자의 실험실적 효능평가와 새로운 형태의 시스테인 단백분해효소와 아스파틱 단백질분해효소의 생화학적 특성을 구명하였다. 이로써 삼일열원충 단백질분해효소의 생화학적 특성 규명으로 억제제를 이용한 치료제 개 발에 기조지견이 확보되었고 새로운 단백운해효소를 발굴하여 치료제 개발에 전기를 마련하게 되었다. 삼일얼원충의 면역학적 특성 분석과 ONA백신개발을 위하여 한국형 삼일열 말라리아 감염된 사람의 면역체계를 triggering 하는 원충 표면 단백질들을 cloning 하고 유전자 재조합을 통하여 대량 생산한 후 마우스에 여러 항원단백질들을 주입시켜 면역반응을 살펴보았다. 삼일열원충의 백신 후보 물질 중 08P 및 AMA-1 의 벡터 내 발현에 성공하였고 사이토킨 생산과 항체가 측정을 통해 마우스에서의 먼역 반응을 알아보았다. 모기의 를혈에 따는 많은 분자적 변화들은 모기나 이를 통해 전파되는 말라리아를 포함하는 모기매개 기생충들에게 중요한 과정이며, 이런 문자적 변화의 profile을 연구하는 것은 매우 중요한 일이다. 한국의 매개모기인 중국얼룩날개 모기를 재료로 모기의 홉혈 여부로 달리 발현되는 유전자를 규명하고자하였다. 홉혈모기와 당섭취모기 그리고 장구벌레의 total RNA를 재료로 총 120 set의 ACP primer를 가지고 ACP(Annealing Control Primer)-PCR 기법을 수행하였다. 이 중 를혈 모기에서만 유전자 발현이 3 배이상 증가되는 DEG 를 분석하였다. 한국의 말라리아 매개 모기인 중국얼룩날개 모기의 분자적 연구에 새로운 이해를 다지는초석이 될 것이다.

국문 초록 (Abstract)

전파차단백신 효과를 판정하기 위한 말라리아 매개모기의 실험실 사육 시도 및 전파차단 백신(Pv25 , Pv28) 의 클로닝을 실시하였다. 백신후보항원 Pv25 , Pv28 의 BALB/c 마우스에서의 면역실험을 통하여, 적은 농도로도 말라리아 환자의 T-cell 수를 효과적으로 증가시킬 수 있는 능력이 확인되었다. 또한 Pv25, Pv28 의 대장균 발현을 통한 의 특성 분석, 바쿨로바이러스에 의한 대량 발현 후, 안전성시험을 살시함으로써 Feild 에 적용을 위한 기초 자료를 확보하였다. 한국인에서의 황말라리아 제재 감수성 분석을 위하여 예방용량의 클로로뀐 투약시의 한국인 정상 성인에서의 약동학적 특성을 분석을 실시하였다. 예방 내성 발현 분석 결과 이미 지난 2000 년부터 예방 내성이 있었음이 확인되었다. 하지만 치료농도에는 전부 반응하였응이 관찰되었다. 한편, 치료용량의 클로로뭔 투약시의 한국인 정상 성인에서의 약동학적 특성도 분석하였다. 이 결과로써 클로로뀐이 주로 작용하는 원충의 분화단계롤 분석한 결과, 클로로뀐은 주로 무성생식기인 분열기에 주로 작용,유성생식기인 생식모세포에는 작용하지 않음이 확인하였다. 국내 삼일얼 말라리아 매개 모기 종의 매개능을 연구하기 위하여 국내 우점 말라리리아 매개모기인 An. sinensis. An. pullus , An. lesteri 에 대한 대량사육을 시도하여 성공하였으며, 이들에 대한 교배실험, 핸형분석, 분자계통 연구를 통해 서로 상이한 종임을 밝혔다. 한편 지금까지 말라리아 매개모기로 알려져 있던 An. sinensis (중국얼룩날개모기)가 매개능이 없음을 확인하였다. 실제 말라리아 매개모기를 규명하기 위한 실험이 추후 진행될 것이다. 국내 우점 말라리리아 매개모기에 대한 대량사육이 가능함으로 이후 살충제 내성연구, 모기 행동연구, 매개능 연구 등에 다양하게 활용될 수 있을 것이다. 한편 지금까지 말라리아 매개모기로 알려져 있던 중국얼룩날개모기가 매개능이 없음을 확인되었으므로 방제 정잭 결정에 활용할 필요성이 있을 것이다. 면역조절세포를 이용한 말라리아원충에 대한 면역증강법을 연구결과, NKT 세포의 리간드인 a-gc를 사용한 NKT 세포의 자극은 merozoit 표면 항원 peptide cocktail OlI 대한 항원 특이적 반응을 증가함이 관잘되었고 MSA peptied cocktail 항원을 실은 골수 유래 수지상세포는 항원에 대해 특이적으로 인터페론 감마를 분비하는 C08+T세포의 증가와 인터퍼

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To evaluate the effectiveness of transmission blocking vaccine, the laboratory cultivation of Anophelis mosquitoes, cloning of Pv25, Pv28 were conducted. It was found that Pv25, Pv28 can enhance good T-cell immunity only with small amount. The characterization was done with E.coli expression system and simple toxixicity test was conducted with purified protein expressed by baculovirus expression system.
To verify the change of anti-malarial drug susceptibility, we analyzed the pharmakokinetic characteristics of chloroquine of prophylactic dose in Korean healthy individuals and therapeutic dose in Korean healthy individuals. We found that the resistance against prophylactic dose had already appealed since 2000, but the patients with the resistance was treated with chloroquine of therapeutic dose. The resistance against therapeuic dose was not found. Chloroquine eradicated efficiently Plasmodium of during schizogony, whereas gametocyte seemed to be refractory to chloroquine.
Mass rearing system of An. sinensis. An. pullus, An. lesteri which are most dominat species of Korean anopheline mosquitoes was established. Karyotypes, hybrid test and DNA sequence comparison for these species were performed. From susceptibility test, it is clearly verified that An. sinensis is not vivax malaria vector mosquito. Mass rearing system can be applied for insecide development, mosquito ethology, and susceptibility test.
In the study of immunology on malaria, stimulation of NKT cells enhanced cytotoxic activity against weak antigens such as B16 tumor antigens was found. Stimulation of NKT cell-associated innate immunity by using αGalCer at the time of immunization with P. falciparum antigen cocktail greatly enhanced the generation of antigen-specific CD8+ T cell population and CTL responses against malarial antigens. MSA peptide cocktail antigen loaded Bone marrow-derived dendritic cells elicited expansion of the antigen-specific IFN-g secreting CD8+ T cells and induced antigen-specific CTL responses. Dendritic cells are potent antigen-presenting cells that play a crucial role in inducing malarial antigen-specific immune responses.
A novel proteases from p. vivax was identified. An analyses of genetic variations of drug-resistance genes and proteases genes in P. vivax wild isolates, an evaluation of cysteine protease inhibitors as antimalarial chemotherapeutics, and characterizations of biochemical and functional properties of cysteine and aspartic proteases of Plasmodium vivax were conducted.
Four major vaccine candidate proteins Circumsporozoite protein (CSP), Duffy-binding protein (DBP), merozoite surface protein-1 (MSP-1), apical membrane antigen-1 (AMA-1), were cloned into pcDNA 3.1(-) vector and expression plasmids were finally constructed. This study found that pAMA1+1L-12 vaccination enhance IFN-r production and may help to protect against the infection of P. vivax. These DNA plasmids are expected to be potential vaccines.
On the other hand , the study of gene expressions among the mosquitoes that blood-fed and sugar-fed can be very important because it will provide a broadened basis for understanding vector-parasite interactions. PCR amplification using species-specific primer identified Anopheles sinensis. The eggs from an An. sinensis female were reared in a separate pan in insectaries, F1 progenies of adults and larvae were used for molecular analysis. To determine the gene expression patterns, differentially expressed gene (DEG) were screened by ACP-based PCR using the Gene Fishing DEG kits. In blood-fed mosquitoes, total 68 DEGs were expressed at least three-fold above their levels in the sugar-fed mosquitoes and larvae. This result will provide a resource for improving annotation of the An. sinensis genome, Importantly, increased understanding of An. sinensis biology at the molecular level may open new avenues for intervention against malaria transmission regulation.