PROTEIN ENGINEERING OF THE STREPTOMYCES RUBIGINOSUS D-XYLOSE (GLUCOSE) ISOMERASE

국문 초록 (Abstract)

Streptomyces rubiginosus에서 생산되는 포도당이성화 효소의 열안정성을 이해하고 식품산업에서의 이용성을 개선하기위하여 이 효소의 구조와 기능과의 관계를 검사하였다. 이 효소는 B.brevis에서 강하게 생성되는 세포벽 단백질의 Promoter를 이용하여 E.coli에서 발현되었으며, 전체 단백질의 7%정도 생성되었다. 이 효소의 최적온도와 pH는 각각 85℃와 8.5이었다. 기존에 제시된 두개의 반응기작을 비교하여 그 반응기작를 밝히고 active site에 위치한 아미노산을 치환하여 기질결합력, 용매교환력에 대한 특성을 검토하였다. H64N은 wt에 비해 약 ??%의 역가를 보였으며, 기질결합력에 있어서 증가된 형광을 보였다. H220N, H220S, 그리고 H220E가 약 0.4-0.5%의 역가를 보인반면 다른 His-220Mutant는 전혀 역가를 나타내지 못하였다. K183M은 기질에 대하여 형광quench를 보인반면 His-220Mutant는 quench를 보이지 않았다. 수소원자가 붙은 기질과 물의 수소원자 교환량은 wt과 F94S에서 0.3-0.5% 내외로 별 차이를 보이지 않았다. wt의 낮은 수소교환속도와 HS4N, His220그리고 Lys183의 기질결합력, 그리고 이성화정도는 이 효소의 반응기작이 hydride-shift 기작을 따른다는 것을 지지하였다.
열안정성에 대한 His220Mutant의 효과가 열변성, 금속친화력, X-ray결정법에 의하여 분석되었다. H220N, H220S, 그리고 H220E는 wt보다 5-20℃정도 낮은 열안정성을 보였다. 감소된 열안정성의 분자학적 연구는 이러한 낮은 열안정성이 M2site에서의 금속결합이 주위여건에 기인한다는 것을 나타내었다. 수개의 Active site Histidine주위의 전하를 띤 아미노산과 표면에 있는 아미노산의 돌연변이는 wt의 최적 pH를 0.8정도 낮추었다. 특히 D56N과 E221A는 pH6과7사이에서 wt보다 높은 역가를 나타냈으며, 높은 열안정성을 유지하였다. 금속특이성 검사는 M2주위에 있는 아미노산이 중요하다는 것을 보여주었다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1 Introduction = 1
• References = 4
• Chapter 2 Literature Review = 5
• References = 32
• Chapter 3 Overexpression of Streptomyces rubiginosus D-xylose isomerase
• 3.1 Introduction = 40
• 3.2 Materials and Methods = 41
• 3.3 Results = 45
• 3.4 Discussion = 51
• 3.5 References = 57
• Chapter 4 Probing the reaction mechanism of D-xylose isomerase : The effect of mutations in active site residues
• 4.1 Introduction = 60
• 4.2 Materials and Methods = 62
• 4.3 Results = 66
• 4.4 Discussion = 91
• 4.5 References = 96
• Chapter 5 Perturbing the metal site of D-xylose isomerase : The effect of the His-220 mutation on stability (J. Biol. Chem. 269 : 2687-2694, 1994)
• 5.1 Introduction = 98
• 5.2 Materials and Methods = 99
• 5.3 Results = 104
• 5.4 Discussion = 121
• 5.5 References = 130
• Chapter 6 Lowering the pH optimum of D-xylose isomerase
• 6.1 Introduction = 133
• 6.2 Materials and Methods = 136
• 6.3 Results = 138
• 6.4 Discussion = 151
• 6.5 References = 162
• Chapter 7 Changing the metal specificity of D-xylose isomerase
• 7.1 Introduction = 166
• 7.2 Materials and Methods = 168
• 7.3 Results = 169
• 7.4 Discussion = 180
• 7.5 References = 184