중간엽 줄기세포를 이용한 난치성 건성안 치료제 개발 = Mesenchymal stem cells for treating refractory dry eye syndrome

국문 초록 (Abstract)

1. 각막상피세포의 염증성 손상과 세포사 생체외 모델 확립 : 중간엽 줄기세포가 각막상피세포의 세포사와 염증에 가지는 효과와 그 기전을 알기 위해 20% ethanol 을 1차 배양한 인간 각막 상피세포에 30초간 처치하여 각막상피세포의 염증성 손상과 세포사 생체외 모델을 확립하였음.
2. 각막상피세포의 염증성 손상과 세포사 생체외 모델에서 골수유래 중간엽 줄기세포의 항세포사 효과 확인 및 치료 인자 선정 : 위 실험에서 확립한 배양 인간 각막상피세포의 세포사 및 염증 모델에 골수유래 중간엽 줄기세포의 배양액을 추가한 후 그 치료효과를 확인하고 배양액내 성분을 분석하여 줄기세포 유래 치료물질을 확인하였음. 즉, 본 연구에서는 중간엽 줄기세포 유래 인자가 손상된 각막상피세포의 세포사를 억제하고 염증을 감소시킴을 확인하였음.
3.염증성 건성안 쥐모델 확립 : 염증에 의한 난치성 건성안 동물모델을 만들기 위해 T cell mitogen 인 Concanavalin A 를 mouse 의 위아래 눈물샘에 농도별 (0, 1, 5, 10 mg/mL)로 주사한 후 1 주째 희생하여 눈물샘 내 염증의 발생을 조직학적 염색과 눈물샘내 T cytokine 인 interleukin(IL)-2 와 interferon (IFN)-γ 의 발현을 평가하여 확인하고 눈물량이 감소하고 안구표면의 상피결손이 증가함을 확인하여 동물모델을 확립하였음.
4. Concanavalin A 에 의한 염증성 난치성 건성안 모델에서 중간엽 줄기세포의 치료효과 분석 : 위에서 확립한 난치성 염증성 건성안 마우스 모델에서 중간엽 줄기세포의 치료효과를 평가하기 위해 Concanavalin A 를 눈물샘에 주사하여 염증성 건성안을 유발한 후 인간 혹은 마우스 골수유래 중간엽 줄기세포를 안와에 주입하였고 일주 후 눈물 분비량이 유의하게 증가하고 안구표면의 상피결손이 유의하게 감소하여 임상적 효과를 확인하였음. 또한 인간 섬유아세포를 동량 주입하였을 때 눈물분비량에 유의한 변화는 없어 이는 중간엽 줄기세포 고유의 작용임을 확인하였음. 또한, 골수유래 중간엽 줄기세포를 안와에 주입하였을 때 눈물샘의 염증 싸이토카인의 양이 유의하게 감소하고 안구표면의 염증싸이토카인의 양이 유의하게 감소함을 확인하여 줄기세포가 눈물샘과 안구표면의 염증을 감소시킴을 확인하여 그 기전을 알아내었음. 이는 줄기세포를 안와에 주입하였을 때 눈물샘내 CD3 T 세포와 Interferon gamma-expressing CD4 T 세포의 침착이 유의하게 감소함과 동반됨을 확인하여 조직학적으로도 재차 줄기세포의 항염증 및 눈물샘 보존 작용을 확인하였음. 또한 안구표면의 goblet 세포의 침착이 중간엽 줄기세포에 의해 유의하게 증가하여 줄기세포의 안구표면 보호 작용을 확인하였음 줄기세포의 기전을 더 깊이 분석하기 위해 마우스 CD4 세포를 혈액내에서 분리하여 Concanavalin A 에 의해 증식과 분화를 유도한 후 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 혹은 인간 섬유아세포와 공동배양하였을 때 CD4 세포의 증식과 Th1 세포로의 분화 정도가 유의하게 감소함을 확인하여 줄기세포가 CD4 T 세포의 증식과 분화를 억제함에 의해 항염증 작용을 함을 확인하였음.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Establishment of in vitro model of corneal epithelial injury : We exposed corneal epithelial cells in culture to ethanol, and evaluated the cells for toxicity, survival, and cell-specific markers and inflammatory cytokines. We found that ethanol decreased the viability of cells in a concentration-dependent manner by causing cell lysis, suppressing proliferation, and inducing apoptosis. Also, expression of corneal epithelial cell-specific markers was significantly reduced by ethanol exposure. Expression of pro-inflammatory cytokines was highly increased in corneal epithelial cells. Data suggest that brief exposure of corneal surface to ethanol may have long-term effects by disrupting the integrity of corneal epithelium and generating inflammation, both of which are precursors to a number of ocular surface diseases.
2. Effects of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) on cultures of corneal epithelial progenitor cells with ethanol injury We injured hCEP by incubation in 20% ethanol for 30 sec, and cultured the cells in fresh medium or in the medium derived from cultures of human dermal fibroblasts (hFb), hMSC, or TNF-α -activated hMSC. After 24 h, we evaluated the survival, proliferation, and apoptosis of the cells. The hMSC-conditioned medium enhanced survival and proliferation, and inhibited apoptosis of chemically injured hCEP. The effects of the hMSC-conditioned medium were increased by pre-incubating hMSC with TNF-α . The increased effectiveness of the medium from the pre-activated hMSC was in part explained by increased concentration of the multifunctional protein stanniocalcin-1 that inhibits apoptosis. Data account for beneficial effects of MSC on hCEP.
3. Mesenchymal stem/stromal cells protect the ocular surface by suppressing inflammation in an experimental dry eye. We investigated the therapeutic potential of MSCs in a murine model of an inflammation-mediated dry eye that was induced by an intraorbital injection of concanavalin A. We found that a periorbital administration of MSCs reduced the infiltration of CD4+ T cells and the levels of inflammatory cytokines in the intraorbital gland and ocular surface. Also, MSCs significantly increased aqueous tear production and the number of conjunctival goblet cells. Subsequently, corneal epithelial integrity was well-preserved by MSCs. Results demonstrate that MSCs protect the ocular surface by suppressing inflammation in DES, and suggest that MSCs may offer a therapy for a number of ocular surface diseases where inflammation plays a key role.