중뇌도파민신경세포의 자발성 신호 발생 다양성 및 선택적 제어기전 연구 = Diversity of spontaneous firing patterns and their selective control mechanisms in the midbrain dopamine neurons

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ. 연구개발의 목적 및 필요성
중뇌 도파민신경계의 활성은 운동, 보상성 행동, 그리고 특정형태의 기억형성에 중요한 역할을 하며, 도파민신경계 기능이상은 운동(파킨슨병, 뚜렛증후군), 학습(ADHD), 감정, 인지 장애(정신분열증), 약물중독과 같은 다양한 신경-정신질환군으로 나타난다. 도파민신경세포의 자발성 활동전압의 발생빈도와 다양한 흥분성패턴은 축삭말단에서의 도파민 분비뿐만 아니라 somatodendritic compartment에서의 도파민 분비도 결정한다. 따라서 도파민신경세포의 발화빈도와 패턴을 선택적으로 조절하는 칼슘신호의 특징 및 조절기전을 규명하여 도파민신경계이상 시 발생하는 다양한 증상의 선택적 조절기전의 가능성을 탐구한다.
Ⅱ. 연구개발의 내용 및 범위
중뇌 도파민신경은 보상과 동기기전, 인지 및 운동조절에 중요한 역할을 한다. 분리한 도파민신경세포는 규칙적인 자발성 활동전압을 보이지만 몸안에서는 규칙적, 불규칙적, 버스트형 발화를 하므로 어떤 조절인자가 있음을 알 수 있다. 중뇌 도파민신경세포는 매우 많은 신경전달물질, 호르몬들이 발화를 조절하며 도파민자체에 의해서도 자가 수용체를 통해 조절 받는 것으로 알려져 있다. 글루탐산은 대표적 흥분성 신경전달물질로 다양한 패턴의 활동전압변동을 야기한다. 글루탐산은 AMPA, kaninate, NMDA 수용체와 대사성 글루탐산수용체뿐만 아니라 전압의존성 칼슘통로를 통해 칼슘을 증가시킨다.수지상돌기에 국소적으로 증가한 칼슘은 발화패턴조절에 중요할 뿐만 아니라 시냅스 가소성도 조절할 것으로 믿어진다. 그러나 도파민신경세포의 수지상돌기에서의 칼슘신호의 특징, 증가기전에 대해서는 현재 알려진 것이 없다. 그러므로 본 과제에서는 글루탐산이 어떻게 칼슘을 증가시키고, 활도전압의 발생에 영향을 주어 다양한 형태의 발화패턴이 나타나는 가를 연구하는 것을 목표로 한다. 특히 도파민수용체의 역할과 더불어 각각의 글루탐산 수용체에 의한 칼슘증가를 수지상돌기의 길이를 따라 시공간적 특징을 파악함으로서 발화빈도와 패턴에 대한 칼슘신호의 역할을 규명하고자 한다.
Ⅲ. 연구개발결과
● 중뇌도파민신경세포는 도파민 자가 수용체를 갖고 있는 것으로 알려져 있지만 자가 수용체의 종류와 기능에 대해서는 논란이 많다. 따라서 본 과제에서 분리한 단일 도파민신경세포에서 발화패턴과 single cell RT-PCR을 통해 도파민 수용체별 발현을 조사하였다.
● 단일세포에서 single cell RT-PCR을 통해 도파민 수용체별 발현을 조사한 결과 D(1), D(2)S, D(2)L, D(3), and D(5) receptor mRNA가 D(2)L > D(2)S > D(3) > D(5) > D(1) 순서로 일정하지 않게 세포별로 발현되었다.
● 퀸피롤로 D2숭용체를 자극한 결과 모든 수용체가 유사한 정도로 자극되었지만 D2와 D3수용체를 같이 발현한 세포에서 가장 강한 억제현상을 보였다. 또한 D2S, D2L, D3수용체의 발화억제는 비슷해 보였다.
● 자발적으로 발화하는 도파민신경세포에서 자발성 발화빈도는 칼슘농도증가와 정비례관계를 형성했다.
● 그러나 Ca caging 과 uncaging 에 의한 점진적 또는 계단식 칼슘증가는 상응하는 발화억제을 보였으며 감소는 발화증가를 보였다.
● 이상의 결과는 자발성 발화를 칼슘에 의한 되먹임기전이 조절함을 시사하며, 20 mM BAPTA 와 같은 완충제에 의해 이 되먹임 현상이 소실되는 것으로 보아 증명할 수 있었다. 이런 상황에서 글루탐산은 더욱 강한 발화증가를 보였다.
● 이상의 결과는 세포 내 칼슘이 자발성 발화의 되먹임 억제에 매우 중요한 역할을 함과 동시에 글룰탐산에 대한 반응성도 조절함을 시사한다.
Ⅳ. 연구개발결과의 활용계획
중뇌 도파민신경세포는 많은 병리적 현상과 생리기전에 연관되어 있다. 매우 작은 소수의 세포가 전체 도파민 레벨을 관장하므로 도파민 신경세포의 기능 조절을 통해 도파민 레벨을 조절하는 기전은 파킨슨병, 정신분열병, 중독, 학습장애와 같은 다양한 질환의 치료기전을 확립하는데 매우 중요하다. 특히 도파민 신경세포의 발화빈도, 패턴은 매우 많은 내외인자에 의해 조절받음으로 자발성 발화빈도를 조절하는 기전을 연구하는 것은 매우 중요하다. 기존 도파민 수용체 길항제와 억제제와는 다른 칼슘신호를 통한 중뇌 도파민신경세포의 흥분성을 활동전압의 패턴 및 빈도를 직간접적으로 제어하는 선택적 기전을 연구함으로서, 도파민신경세포 관련 증상의 정확한 선택적 제어방법을 제시함으로서 도파민신경세포의 발화를 선택적으로 조절할 수 있는 기반을 제공할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

1. Aims and needs of the project
Activation of the midbrain dopamine systems facilitates locomotion, reward-related behaviors, and some types of memory formation and impairment of their function is involved in many neuropsychiatric disorders, such as Parkinson’s disease, schizophrenia, Tourette’s syndrome, and drug addiction. The rate and pattern of spontaneous firing determine dopamine release from axon termini as well as from somatodenritic compartments, and finally setting phasic and tonic concentration of dopamine in the target areas and extracellular space in the brain. Therefore, Ca2+ signals and cellular mechanisms of dopamine neuron for firing activity could be very important in understanding and treatment of many neuropsychological diseases.
2. Research design and proposal
In the dopamine neurons, many neurotransmitter and hormones including dopamine itself participate in regulation of firing rate. Dopamine neurons are known to have dopamine autoreceptors. Glutamatergic afferents are a major input and elicit diverse firing patterns such as regular, irregular, and weak or strong burst discharges. Glutamate can raise Ca2+ in a local domain through AMPA, kainate, NMDA, and metabotropic glutamate receptors as well as through a consequential activation of various voltage-operated Ca2+ channels. We believe that local levels of Ca2+ in dendrites not only important to determine firing patterns but also affect types of synaptic plasticity. However, there are no available data on the sources for Ca2+ influx and release along a dendrite in the dopamine neurons. Therefore, in this project we shall try to reveal exact roles of glutamate receptors on the regulation of Ca2+ signals and firings depending on the locations in the dendrite and soma in the midbrain dopamine neurons, together with some of important factors regulating firing rate and patterns in the midbrain dopamine neurons.
3. Result
● When we performed single-cell RT-PCR experiments, D(1), D(2)S, D(2)L, D(3), and D(5) receptor mRNA were heterogeneously expressed in the order of D(2)L > D(2)S > D(3) > D(5) > D(1).
● Stimulation of D(2) receptors with quinpirole suppressed spontaneous firing similarly among all neurons expressing mRNA solely for D(2)S, D(2)L, or D(3) receptors. However, quinpirole most strongly suppressed spontaneous firing in the neurons expressing mRNA for both D(2) and D(3) receptors. These data suggest that D(2) S, D(2)L, and D(3) receptors are able to equally suppress firing activity, but that D(2) and D(3) receptors synergistically suppress firing.
● In the spontaneously firing dopamine neurons, when we increased spontaneous firing rate with low doses of glutamate or KCl, the rise in global [Ca2+]c levels was correlated with the spontaneous firing rate.
● However, gradual or stepwise increases in [Ca2+]c by NP-EGTA Ca2+ uncaging suppressed the spontaneous firings proportionally and lowering of [Ca2+]c by diazo Ca2+ caging raised firing rate.
● These data indicate that the Ca2+-mediated feedback regulation mechanism tunes spontaneous firing activities at basal Ca2+ levels through Ca2+-activated K+ channels. When we blocked this feedback inhibition mechanism of spontaneous firing with dialysis of 20 mM BAPTA, the glutamate-induced enhancement of firing rate was significantly exaggerated compared with those of control condition.
4. Research Implication
The midbrain dopamine neurons are known to play key roles in many pathophysiological processes. From this project, we conclude that cytosolic Ca2+ changes at basal levels tunes spontaneous firing rate and that this Ca2+-mediated feedback regulation mechanism modulates glutamate responsiveness in the midbrain dopamine neurons. This study may eventually provide basic information on the firing mechanisms through dendrites, which are vital to understand the basic functions of dopamine neurons