생쥐 뇌조직의 단일세포 전사체를 이용한 생물정보학 분석 도구의 비교 평가

국문 초록 (Abstract)

기존의 대량 전사체 분석 방법은 다수의 세포에서 추출된RNA를 이용하여 유전자 발현량의 평균을 측정하는 반면, 단일 세포 전사체 분석은 개별 세포에서 추출한 전사체를 분석하여 유전자 발현을 독립적으로 측정한다. 현재 널리 사용되는 생물정보학 분석 도구인 Scanpy와 Seurat는 단일 세포 전사체 데이터의 전 처리 및 분석 과정 전반에서 유용하게 활용되는 다양한 기능을 제공한다. 하지만 그 방법론 및 구현 방식의 차이로 인해 서로 다른 결과가 도출될 수 있다. 본 연구는 생쥐 뇌 조직의 단일 세포 전사체 데이터를 Scanpy와 Seurat으로 각각 분석하여 그 결과를 비교 평가하였다.
낮과 밤에 각각 채취한 생쥐의 뇌 조직을 Adult Brain Dissociation Kit를 사용하여 단일 세포로 분리하였다. 전사체 추출과 라이브러리 제작을 위해 Chromium Next GEM Single Cell 3’ Reagent kit를 사용하였고, HiSeqXten으로 서열을 분석하였다. 발현된 유전자의 개수와 미토콘드리아 전사체의 비율을 이용하여 데이터를 정제하였다. 정규화와 차원 감소를 수행한 후 DoubletFinder와 scrublet을 사용하여 중첩세포를 제거하였고, 단일 세포로 판별된 낮(CT50)과 밤(CT62) 검체 데이터를 병합하여 분석하였다. Resolution 설정 값을 다양화(0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3)하여 두 도구에 의한 군집화 결과를 비교하고, Seurat은 ScTypeDB와 ScType를, Scanpy는 PanglaoDB와 decoupleR를 사용하여 세포 유형을 할당하였다.
중첩 세포 제거 후 Seurat과 Scanpy가 각각 판별한 단일 세포의 수는 CT50 표본에서 948개와 995개였고, CT62 표본에서는1,236개와 1,308개였다. 병합 표본에서 Seurat과 Scanpy는 2,184개와 2,303개의 단일세포를 판별하였고, 이 중 두 도구가 공통적으로 판별한 단일세포는 2,182개였다. 같은 Resolution 값을 설정하였을 때 Scanpy가 더 많은 수의 세포 군집을 형성한 반면, Seurat은 UMAP상에서 경계가 더 명확한 군집을 형성하였다. 두 도구가 서로 다른 세포 유형으로 할당한 세포 수의 비율은 Resolution 값에 영향을 받았고, 특히Resolution을 낮게 설정했을 때 neurons는 검출되지 않았다. 또한, Seurat은 기존에 잘 알려진 유전자 마커에 기반하여 세포 유형을 할당하는 특징을 보였다. Seurat과 Scanpy 모두에서 pseudocount 계산 방식의 변화는 차등 발현 유전자 분석 결과에 영향을 미쳤다. 우리는 세포 수, PAGA 및 UMAP 분석 결과를 종합적으로 반영했을 때 차등 발현 유전자 분석을 위한 최적의 Resolution값 선정이 가능함을 확인하였다.
본 연구는 Seurat과 Scanpy를 이용한 단일세포 전사체 데이터 분석에서Resolution 설정에 따라 도출되는 결과가 달라질 수 있으므로, 검체의 종류와 분석 목적에 따라 적절한 분석 도구와 최적의 Resolution을 선정해야 함을 분명히 보여준다. 본 연구가 제시한 두 도구의 비교 결과는 향후 단일세포 전사체 생물정보학 분석의 가이드라인으로 활용될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Traditional bulk transcriptome analysis calculates the mean of gene expression levels in numerous cells, while single-cell transcriptome analysis measures the gene expression independently in individual cells. The two well-known bioinformatics tools, Scanpy and Seurat have been used to analyze single-cell transcriptome data. Each tool has its own distinct methodologies and modules that could give us different results. In the current study, we assessed and evaluated the outcomes from Scanpy and Seurat by analyzing single-cell transcriptome data obtained from mouse brain tissue.
The brain tissues of mice collected during the day (CT50) and night (CT62) were isolated into single cells using an Adult Brain Dissociation Kit. Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent kit was used for RNA extraction and library construction, and the sequence was analyzed with HiSeqXten. Data were filtered based on the number of expressed genes and the ratio of mitochondrial transcripts. After normalization and dimensionality reduction, overlapping cells were removed using DoubletFinder and scrublet. Cell clustering was performed at various resolutions (0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3). For cell type assignment, Seurat utilized ScTypeDB and ScType, while Scanpy employed PanglaoDB and decoupleR. Differentially expressed genes were analyzed by cell type, at resolutions 0.5 and 2.
Seurat and Scanpy detected 948 and 995 single-cells in the CT50, and 1,236 and 1,308 single-cells in the CT62, respectively. In the merged sample (CT50 and CT62), Seurat and Scanpy identified 2,184 and 2,303 single-cells, respectively. Among them 2,182 single-cells were co-identified with both tools. The main difference between the two tools in cell clustering result was that at the same resolution, Scanpy produced a greater number of cell clusters, while Seurat's clusters had clearer borders without overlapping on Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plots. In the cell type assignment, Seurat was heavily influenced by well-known genetic markers, and the proportions of cells assigned to different cell types by both tools was influenced by the resolution parameter. We found that the results of cell number, Partition-based graph abstraction (PAGA), and UMAP analysis should be comprehensively reflected in order to optimally set the pseudocount value which greatly affects the differential expression gene analysis results by Seurat.
In conclusion, the choice of bioinformatics analysis tool and parameter settings can significantly influence the outcomes of single-cell transcriptome analysis. Therefore, selecting an appropriate analysis method aligned with the sample type and research objectives is essential. The comparative findings from this study can serve as valuable guidance for future single-cell transcriptome bioinformatics analyses.

목차 (Table of Contents)

• 초 록 iv
• 1. 서 론 1
• 2. 실험 방법 3
• 3. 실험 결과 7
• 4. 고 찰 35
• 5. 결 론 37
• 6. 참고 문헌 38
• Abstract 39