제대혈 채취 후 유로키나제의 첨가가 제대혈 적혈구 제거시 조혈모세포의 수득률에 미치는 영향 = The Effect of Urokinase in Anticoagulated and Elapsed Cord Blood on the Yield of Progenitor Cells after Red Cell Depletion

국문 초록 (Abstract)

목적:제대혈 채취 후 24시간이 경과하여 적혈구를 제거하는 경우에 제대혈내의 응고계 및 섬유소 융해계의 변화로 인하여 clumping이나 미세혈전 등이 생겨 유핵세포나 CD34+ 세포의 수득률이 감소될 수 있다. 따라서 비록 항응고제가 처리된 제대혈이라 할지라도 제대혈 분리 전에 urokinase를 첨가하면 조혈모세포의 수득률을 높일 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 현재까지 이에 대한 연구가 전혀 없는 상태이므로, 본 연구에서는 시간이 경과된 제대혈에 urokinase를 첨가하는 것이 효과가 있는지, 있다면 얼마의 용량이 적절한지 알아보기로 하였다.
방법:1) 채취한 후 48시간 경과된 제대혈에 대한 분석: 15례의 제대혈을 채취하여 채취 직후와 48시간 후에 10% pentastarch로 적혈구를 분리한 다음, 총유핵세포수와 CD34+ 세포수를 측정하여 수득률을 비교하였다. 48시간이 경과한 검체에 대하여 urokinase는 제대혈 분리 30분 전에 첨가하였으며, urokinase를 첨가하지 않은 군과 urokinase 5,000 IU/mL, 10,000 IU/mL, 50,000 IU/mL을 첨가한 네군으로 나누어 각각의 수득률을 비교 분석하였다. 2) 채취한 후 24시간이내의 제대혈에 대한 분석: 12례의 제대혈을 채취한 직후에 적혈구를 분리하여 총유핵세포수와 CD34+ 세포수, CFU-GM 집락수를 측정하였다. 동일한 검체를 6시간, 12시간, 24시간 동안 실온에 방치한 후 상기 실험 결과 가장 효과적인 용량의 urokinase를 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누어 각각 적혈구를 분리한 다음, 총유핵세포수와 CD34+ 세포수, CFU-GM 집락수를 측정 비교하였다.
결과:1) 제대혈 채취 48시간 후에 urokinase를 첨가하지 않은 경우와 urokinase 5,000 IU/mL를 첨가한 경우 총유핵세포수의 차이가 없었지만, urokinase 10,000 IU/mL, 50,000 IU/mL를 첨가한 경우에는 urokinase를 첨가하지 않은 경우에 비하여 총유핵세포수의 의미있는 증가를 보였다(P=0.0024, P=0.0009). 2) 제대혈 채취 48시간 후에 urokinase 5,000 IU/mL이나 50,000 IU/mL를 첨가한 경우에는 urokinase를 첨가하지 않은 경우에 비하여 CD34+ 세포수의 차이가 없었지만, urokinase 10,000 IU/mL를 첨가한 경우에는 urokinase를 첨가하지 않은 경우에 비하여 CD34+ 세포수의 의미있는 증가를 보였다(P=0.0402). 3) Urokinase 10,000 IU/mL를 첨가하였던 군이나 첨가하지 않았던 군 모두에서 제대혈 채취 즉시 적혈구를 분리하였던 경우에 비하여 6시간, 12시간, 24시간이 경과할수록 총유핵세포수, CD34+ 세포수, CFU-GM 집락수가 약간씩 감소하였으나 시간경과에 따른 통계적 차이는 없었다. 또한 제대혈 채취 24시간 이내에는 각 시간대별로 urokinase 10,000 IU/mL 첨가 유무에 따른 총유핵세포수, CD34+ 세포수, CFU-GM 집락수의 통계적 차이를 나타내지 않았다.
결론:채혈한지 48시간 경과된 제대혈을 냉동 보관해야 하는 경우에는 urokinase 10,000 IU/mL를 첨가하고 30분 후에 적혈구를 분리하는 것이 유핵세포와 CD34+ 세포의 수득률을 높일 수 있는 방법이며, 24시간 이내에 적혈구를 분리하는 경우에는 urokinase를 첨가할 필요가 없을 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background:We assessed whether the urokinase could increase the yield of progenitor cells during processing in elapsed, even anticoagulated, cord blood after collection, and also determined the optimal dosage of urokinase.
Methods:Twenty-seven cord blood samples were collected with ACD-coated syringes from umbilical cord vein after full-term vaginal delivery, and red cells were depleted with 10% pentastarch. We assessed the effect and optimal dosage of urokinase by comparing total nucleated cell (TNC) counts and CD34+ cell counts between fresh and 48 hour-elapsed cord bloods. The urokinase was administered to the 48 hour-elapsed cord bloods 30 minutes before separation as the dose of 0 IU/mL, 5,000 IU/mL, 10,000 IU/mL and 50,000 IU/mL, respectively. Thereafter, by using the most effective dosage of urokinase, we also assessed the effect of urokinase in the 6, 12 and 24 hour-elapsed cord bloods.
Results:The TNC counts after separation in 48 hour-elapsed cord bloods were significantly higher in 10,000 IU/mL and 50,000 IU/mL of urokinase treated samples than untreated and 5,000 IU/mL treated samples. The CD34+ cell counts were significantly higher in 10,000 IU/mL of urokinase treated samples than untreated and 5,000 or 50,000 IU/mL treated samples. In 6, 12 and 24 hour-elapsed cord bloods, however, there were no significant differences of TNC count, CD34+ cell count and CFU-GM count between 10,000 IU/mL of urokinase treated samples and untreated samples .
Conclusion: The addition of 10,000 IU/mL of urokinase before separation of 48 hour-elapsed, even anticoagulated, cord bloods could increase the yield of progenitor cells. However, there are no advantage of urokinase for processing of cord bloods not elapsed 24 hours after collection.