류마티스 관절염 진단/치료용 히알루론산 기반 광학영상 복합 약물전달시스템 개발 = Development of hyaluronic acid based optically labeled drug delivery system for theranostic approach of rheumatoid arthritis

국문 초록 (Abstract)

Ⅰ.연구개발의목적및필요성
히알루론산 나노입자 기반 복합기능 고분자 전달체를 기반으로 류마티스 관절염의 광학영상진단과 동시에 치료약물을 선택적으로 전달함으로써 효율적인 치료와 진단을 병행할 수 있는 자극 감응형 복합기능 나노입자와 표준약제 봉입 히알루론산 나노입자를 개발하고, 류마티스 관절염 치료 효과를 검증하며 나아가 그 작용기전을 규명하여 임상적 적용에 최대한 근접할 수 있는 원천 기술을 개발하고자함.
Ⅱ.연구개발의내용및범위
1) 히알루론산 나노입자 제조 및 약물봉입법 확립
2) 대식세포에서 히알루론산 기반 나노입자의 섭취능 및 in vitro 작용기전 규명
3) 히알루론산 기반 나노입자를 이용한 광학영상 in vivo 작용기전 규명
4) 마우스 CIA 모델에서 히알루론산 기반 나노입자를 이용한 치료효과 검증
5) 히알루론산 수용체 결핍 마우스를 이용한 HA-NP기반 약물전달효율성 및 기전 규명
Ⅲ.연구개발결과
소수성 담즙산을 이용하여 히알루론산 나노입자를 제작한 후 나노입자의 비표적 장기로의 이동을 최소화시키기 위해 polyehtylene glycol을 화학적으로 결합한 유도체를 제조하여 물리화학적 특성을 확인하였음. 또한 인산칼슘 미네랄로 생체안정성이 강화된 유.무기 히알루론산 나노입자를 제조하여 염증조직의 산성환경에서 효율적으로 약제방출을 할 수 있도록 구조개선 작업을 수행하였고, 페길화된 히알루론산의 카르복실기와 결합한 인산칼슘이 체내 산성 환경에서 선택적으로 약물방출가능한 구조적 특성을 확인하였음. 염증조직내 대식세포에서 나노입자의 섭취능을 확인한 결과 단핵구보다 대식세포에서 다량의 나노입자가 축적되어 있었고 대식 세포 아형 분화에 따라 나노입자의 섭취능의 차이를 확인하였으며 M2 대식세포에서 나노입자 섭취기능이 높게 유지됨을 확인함. 활막조직에 분포하는 내피세포 및 중간엽세포의 나노입자 섭취기능을 확인한 결과 활막에 존재하는 다양한 세포들에서 나노입자 섭취능이 관찰되었음. 대식세포의 나노입자 섭취기전 연구결과 나노입자는 히알루론산 특이적 수용체와 결합후 clathrin 매개 endocytosis를 통해 세포내에 축적됨을 확인하였으며 히알루론산 나노입자는 CD44 및 Stabilin-2 와의 특이적 결합에 의해 세포내 유입이 이루어짐을 확인하였음. 또한 나노입자의 세포내 미세 organelle에서의 분포 및 세포질내의 기능을 확인한 결과 early endosome과 lysosome에 colocalization되어 약제 봉입한 나노입자가 관절염 조직으로 이동한 후 탐식된 염증 세포내에서 약제를 효율적으로 해리할 가능성을 제시하였음. 나노입자의 광학영상효과를 검증하기 위해 마우스 관절염 모델에서 HA-NP 프로브를 정맥 주사하여 실시간으로 확인한 결과 일정량의 형광강도를 유지하고 있었으며 관절염 조직 내에 HA-NP와 표면 개질한 HA-NP 프로브를 탐식하고 있어 염증 부위로의 HA-NP 표적지향성 이동을 나타내었음. 표면개질한 히알루론산 나노입자와 인산칼슘화 PEG 히알루론산 나노입자에 표준 항류마티스약제를 봉입하여 투여 후 관절염 조직 이동을 확인한 결과, 인산칼슘화 PEG 히알루론산 나노입자기반 약물전달체가 염증 부위으로 다량 이동하여 표적 지향성이 최적화된 관절염 관절염 치료제로의 가능성을 보여짐. HA-NP 기반 약물전달체가 마우스 CIA 모델에서 관절염 진행에 효과적인 억제 치료 효과을 나타날 수 있는지 확인하기 위해 약제의 free form과 HA-NP 약제전달체, PEG HA-NP 약제전달체 및 인산칼슘화 PEG HA-NP 약물전달체를 투여 후 관절염 활성정도를 확인한 결과, 약제전달체 치료그룹이 MTX약제 Free form보다 비교적 효과적인 치료 효과를 보였음. 소수성 약제전달복합체를 마우스 CIA 모델에 투여 후 항염증 효과를 확인함으로써 부작용으로 관절염치료에는 사용이 어려웠던 약제를 봉입할수 있는 약물전달체의 관절염 치료제로써의 가능성을 확인함.
IV.연구개발결과의 활용계획
1) 본 연구에서 개발한 표적지향적 및 생체친화적인 광학영상 복합약물전달체를 이용하여 항염증 진단 및 치료제 개발시 조기진단 및 독성대비 치료효과를 증진할 수 있음.
2) 고부가가치의 복합기능 의약품 개발 원천 및 응용기술을 확보함으로써 theranostics분야에 있어 국가 경쟁력을 제고할 수 있음.
3) 류마티스 관절염 진단 및 치료용 신기술개발에 본 연구의 플랫폼을 통한 시간과 비용을 단축할 수있음.
4) 류마티스 관절염 등 만성 염증성 난치병을 진단하고 효과적인 치료에 적용가능함.
5) Theranostics 분야의 창의적 복합융합기술로 고급인적인프라구축 및 신기술 개발의 초석을 마련함.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this project was to investigate stimulus-sensitive complex functional nanoparticles and hyaruronan nanoparticles containing standard disease-modifying anti-rheumatic drugs that can be applied for the diagnosis and effective treatment of rheumtoid arthritis, which were tested using primary cell line-based study and in vivo animal arthritis models. In order to enhance target selectivity of hyaruronan nanoparticles(HANP) in chronic inflammatory arthritis, several modifications were applied, including PEGylation and mineralization. Macrophages revealed effective endocytosis of HANP, which were blocked by anti-CD44 and anti-stabilin2 antibodies. HANP showed a differential uptake pattern according to macrophage phenotypes, such as classically activated and alternatively activated macrophages. HANP localized at early endosomes which later colocalized with lysosomes, thereby resulting that methotrexate enclosed in HANP can be released at late endosomes which further spilled into the cytoplasm. In vivo study showed that HANP labeled with Cy5.5 can be selectively accumulated into inflamed synovial tissues, but it also localized into the liver, which may cause hepatotoxicity. To circumvent hepatic infiltration, PEGylation on HANP was performed. Although target selectivity was improved, overall delivery into arthritic tissues was reduced. To improve delivery into inflamed tissue, HANP was modified by mineralization which resulted in selective delivery into inflamed tissues, where pH is low enough to cause demineralization. In conclusion, chemical modifications of HANP were effective in enhancing target selectivity of arthritic tissues, thereby increasing sensitivity of diagnostic imaging and reinforcing the efficacy of current anti-rheumatic drugs while reducing adverse effects.