마우스 줄기세포 배상체를 이용한 발생독성시험법 개발 연구 = Establishment of developmental toxicity test method using mESC-derived embryoid bodies

국문 초록 (Abstract)

배아줄기세포를 이용한 시험법 EST는 다양한 물질들의 발생독성을 평가하기에 유용하고 동 물을 사용한 발생독성시험법을 대체하기 위해 개발되었다. EST는 동물 시험법에 비해 소량의 물질을 이용해 짧은 기간 동안에 빠르고 정확하게 독성을 평가할 수 있다는 장점이 있다. 배 상체는 배아 분화과정에서 요구되는 3배엽 요소를 모두 포함하고 있어 분화의 시작점이고, 이 러한 특성은 초기 배아의 발생독성을 평가하기에 유용하다. ECVAM에서 제시한 EST는 미분 화 상태의 배아줄기세포와 분화된 상태의 체세포 (3T3 세포)에서 시험물질의 세포독성 정도 를 MTT 방법을 사용해 평가하고 세포생존율 50% 억제 농도를 산출한다. 또, 배아줄기세포의 심근 분화동안에 시험물질을 처리해, 수축이완 작용을 하는 심근세포군집의 비율로서 심근분 화 50% 억제 농도를 산출한다. 그런데 이러한 심근분화과정은 소요시간이 길고 더 많은 노동 력을 요구하며 개인 오차가 발생할 확률이 높다. 이 연구에서는 이를 개선하기 위해 분화과정 에 요구되는 배상체 단계에서 배상체의 단면적을 활용해 시험물질의 독성을 평가함으로써, 소 요시간을 단축하고 노동력 소비를 최소화하고자 하였다. 배상체 면적은 위상차 현미경 하에서 촬영한 사진을 바탕으로 흑백전환을 통해 배상체가 차지하는 검은 픽셀을 배상체의 수로 나 누어, 배상체 하나당 면적을 얻었다. 배상체 면적은 시험물질의 농도 의존적인 감소 양상을 보이고 심근분화에서 독성정도와도 비례적인 상관관계를 보였다. 이처럼 본 연구진의 배상체 를 이용한 발생독성시험법을 ‘Embryoid Bodies Test’를 약칭해 EBT라고 칭하였다. EBT를 활용해 6개의 비 독성물질, 15개의 독성물질에 대한 발생독성 평가를 수행하였고, 이로부터 얻어진 값을 이용하여 독성 예측모델을 구축하였다. 이를 ECVAM에서 제시한 EST와 비교한 결과, EST는 82.1%의 예측 정확도를, EBT는 85.7%의 정확도를 보여 좀더 높은 정확도를 보 였다. 본 연구진의 EBT는 초기 발생단계에서 다양한 물질들의 발생독성을 빠른 시간 내에 적 은 노동력으로 평가할 수 있는 유용한 방법이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Embryonic stem cel test (EST) has ben developed to replace animal experimentation and to evaluate the embryotoxic potential of several substances. EST can suply more rapid, precise and relevant information than some animal studies, and is an economical aproach due to a low compound requirement and short duration. Embryoid bodies (EBs) act as the onset of diferentiation and have an advantage in the evaluation of developmental toxicity. Mouse EST sugested by ECVAM has ben used to ases the 50% inhibitory dose of chemicals in thre endpoints; viability of undiferentiated ESCs (IC50 D3) and mouse fibroblasts (3T3 cels, IC50 3T3), and diferentiation of ESCs into cardiomyocytes (ID50). In this study, the area of mouse EBs replaced cardiomyogenesis of ESCs to reduce the ned for time-consuming and laborious proceses. 21 compounds, including six non-embryotoxic and fiften embryotoxic/teratogenic chemicals, were evaluated by this modified EST, termed EBT. Section images of EBs were obtained using a phase-contrast microscope and EB area was analyzed using image analysis software. The area of EBs was dose-dependently reduced by chemicals, and ID50 mEB value is derived from the logarithmic graph. Decline in EB area resulted in decrease of beating ratio in diferentiated mESCs. The 50% inhibitory dose in EB area (ID50mEB) coresponded roughly with the doses that decreased beating ratio by 50% (ID50). In our EBT, developmental toxicity of chemicals was evaluated and clasified by prediction model reflecting inhibition inviability and decline in EB area. Exposure to toxicants results in increased cel death and reduction in EB’s area. Our EBT is a novel toxicological screning system and is a useful tol to ases and clasify various embryo-toxic substances in a short time.