국내 임상 환자로부터 분리한 Chlamydia pneumoniae의 분자생물학적 특성 = Biomolecular characterization of chlamydia pneumoniae strain isolated to patient from Korea

국문 초록 (Abstract)

Chlamydia pneumoniae는 1986년 처음 동정된 균종으로 절대 세포내 기생성세균으로 사람에게 폐렴, 기관지염, 인후염, 부비동염 등을 흔히 일으키는 호흡기계질환 병원체이다. 특히 지역사회획득 폐렴(community acquired pneumoniae)의 주요한 원인균 중 약 6～25% 정도를 차지하고 있다. C. pneumoniae에 대한 혈청학적 조사결과 성인집단에서 높은 항체가 보유가 확인되어 일생동안 재감염이 흔하게 발생하는 것으로 추정하였다. 한편, 1990년 초반부터 C. pneumoniae 감염과 동맥경화증과의 관련성에 관한 논란이 끊임없이 이어지고 있으며 관련 연구가 활발하게 진행되고 있다. C. pneumoniae의 감염 진단에 있어 일반적으로 수행되고 있는 혈청학적 방법은 결과판독이 주관적이고 감염 후 항체가 형성되기까지 몇 주가 소요된다는 점과 항체가 만으로는 현증과 과거력을 구별하기가 어렵다. 환자 가검물로부터 세포배양을 통한 C. pneumoniae 분리 및 증식은 많은 노력과 장시간이 요구될 뿐 아니라 민감도가 낮다는 단점이 있다. 이런 이유로 오늘날까지도 C. pneumoniae의 분리는 외국에서도 소수의 센터에서만 성공하였으며 국내에서는 환자로부터 순수 분리 배양된 보고가 없다.
따라서 본 연구에서는 국내 환자 검체로부터 C. pneumoniae를 순수분리하고 외국 분리균주와의 비교를 통하여 국내 임상 분리균주의 특징을 밝히고자 하였다.
먼저, 외국 분리균주인 C. pneumoniae TW-183과 C. pneumoniae KKpn-1을 표준균주로 사용하여 C. pneumoniae의 확인 동정법 및 배양법을 표준화하였다. 한편, C. pneumoniae 검출 및 확인동정에는 미세면역형광법(micro-IF)과 PCR법을 사용하였다.
실험실 조건에 맞춰 확립한 진단법에 따라 직접 임상검체로부터 C. pneumoniae 분리를 시도하여 급성 인두염을 앓고 있는 22세 여자 환자의 비인두 도찰물로부터 micro-IF 결과 양성, PCR 결과 양성을 확인하였고, 배양을 통해 C. pneumoniae를 최종적으로 분리하였다. 분리한 C. pneumoniae 균주를 전자현미경으로 관찰한 결과 elementary bodies(EBs)가 좁은 세포질 공간을 가지는 원형을 띠며 KKpn-1 균주와는 같지만 배 모양(pear-shape)을 띠고 있는 TW-183 균주와는 형태적인 차이가 있음이 확인되었다. 이상의 결과로부터 국내 최초로 C. pneumoniae 분리에 성공하였음을 최종 확인하여 이를 C. pneumoniae LKK-1으로 명명하였다.
C. pneumoniae LKK-1의 생물학적, 유전학적 특성을 분석하고 TW-183 및 KKpn-1 균주와의 차이점을 확인하였다. 증식양상은 세 균주가 거의 같은 양상을 보여서 36시간부터 감염율이 증가하기 시작하여 대략 60시간에 정점에 이르렀다. EBs의 총 단백질 양상을 SDS-PAGE를 수행하여 확인한 결과 양의 차이는 있었지만 거의 비슷하였다. 주 단백은 98, 60 39.5 kDa이었고 39.5 kDa의 위치에서 C. pneumoniae major outer membrane protein(MOMP)으로 확인되었고 몇몇 부분에서 KKpn-1과는 거의 유사하였지만 TW-183과는 차이를 나타내는 부분이 있었다. 한편, pmp2 와 pmp6 유전자에 대한 PCR-RFLP를 수행하여 균주 간 유전자상의 차이를 확인하였다. 또한, 16s rRNA와 ompA, omcB, ompB, G1 유전자의 DNA 염기서열 분석을 실시한 결과 LKK-1 균주는 16s rRNA와 ompA, omcB, groESL 유전자에 있어서 다른 두 균주와 상동성이 100% 였지만 ompB 유전자 염기서열 분석에서는 다른 두 균주와 상동성이 77.5%로 확인되었다.
앞으로 C. pneumoniae의 병원성과 관련된 유전자들의 분자생물학적 특성을 좀더 파악하여 국내 분리 균주의 특성 및 병원성과의 연관성 그리고 새로운 분자생물학적 진단법 개발 연구가 진행되어야 할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chlamydia pneumoniae, firstly discovered in 1986, is an obligate intracellular pathogen that causes respiratory tract infection such as pneumonia, bronchitis, pharyngitis and sinusitis in human. It has been reported to be responsible for 6～25% of case of Community-acquired pneumonia. Serological studies have reported the prevalence of C. pneumoniae specific antibodies is high in the adult population and have suggested the reinfection of C. pneumoniae is common event. Since early 1990's, the possible involvement of C. pneumoniae in the pathogenesis of atherosclerosis has been intensely continued to debate and serologic analysis, at present the test most often used for routine diagnosis, is often subjective, because it take perhaps weeks to detect a significant increase in antibody titers and it is impossible to determine if a patient's antibody titer is due to acute, previous or chronic C. pneumoniae infection. The isolation and propagation of C. pneumoniae from clinical specimens by using cell cultures is relatively labor-intensive and insensitive. Till now isolation of C. pneumoniae from specimens has been successful at few laboratories, but there is no report of isolation of C. pneumoniae from the patient in Korea.
Therefore, in this study, C. pneumoniae was isolated from the patient in Korea and characterized through comparing with other countries' strains.
In an attempt to standardize the identification and culture method of C. pneumoniae, C. pneumoniae TW-183 and KKpn-1, reported in other countries, were used as the control strain. In addition, microimmunofluorescence(micro-IF) assay and PCR method were used for the detection of C. pneumoniae.
The isolation of C. pneumoniae was attempted directly from clinical specimens by using the standard diagnostic methods, and finally, C. pneumoniae was isolated from throat swab specimen of the 22-year female with pharyngitidis under standardized culture conditions and confirmed the positive result by micro-IF assay and PCR method, respectively. Observation with electron microscope demonstrated that C. pneumoniae in this study is a round-shape with cytoplasmic space and its shape was morphologically similar with C. pneumoniae KKpn-1 strain, but was different to pear-shape of C. pneumoniae TW-183. Finally, it was confirmed that the isolation of C. pneumoniae from clinical specimen was successful based on these result and C. pneumoniae in this study was named as LKK-1.
To identify the biological and genetic characteristic of C. pneumoniae LKK-1 and compare it with other strain, TW-183 and KKpn-1, the protein profiles of EBs of C. pneumoniae LKK-1 was analyzed using Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE). In addition, pmp6-based PCR-RFLP produced the different DNA restriction fragment patterns among three strains(LKK-1, TW-183 and KKpn-1). Compared to the degrees of conservation of the 16s rRNA and several MOMp gene, there was a few differences of ompB gene sequence within the three strains.
In future study, further extensive investigation of molecular genetic analysis of the virulent genes in C. pneumoniae are required in order to characterize the C. pneumoniae clinical isolate in Korea and identify the association with pathogenesis of C. pneumoniae infection.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• List of Figure = ⅰ
• List of Table = ⅳ
• Abbreviation = ⅴ
• 논문개요 = 1
• Ⅰ. 서론 = 3
• Ⅱ. 재료 및 실험방법 = 10
• 1. 균주와 세포주 = 10
• 2. C. pneumoniae 분리 배양 = 11
• 2.1. 사용배지 = 11
• 2.2. C. pneumoniae의 배양과 검체 접종 = 11
• 3. C. pneumoniae 확인 동정법 = 12
• 3.1. 직접 면역형광염색법 = 12
• 3.2. DNA 분리 = 13
• 3.2.1. 가검물 = 13
• 3.2.2. 배양세포와 배양액 = 13
• 3.3. PCR = 13
• 4. 가검물에서 C. pneumoniae 분리 = 15
• 5. 전자현미경 검경 = 15
• 6. 성장곡선 = 18
• 7. 분리주의 배양조건 확인 = 18
• 7.1. 세포주들의 비교 = 18
• 7.2. 숙주세포의 DEAE-dextran 전처리 효과 = 19
• 7.3. Cycloheximide의 영향 = 19
• 7.4. 원심분리력과 원심분리 시간의 영향 = 19
• 7.5. FBS의 농도에 따른 영향 = 19
• 8. 분리주 (C. pneumoniae LKK-1)의 특성 = 20
• 8.1. EBs의 분리 = 20
• 8.2. SDS-PAGE를 이용한 총 단백 확인 = 20
• 8.3. PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) = 21
• 8.4. 유전자의 염기서열 분석 = 22
• Ⅲ. 결과 = 24
• 1. C. pneumoniae의 확인 진단법 검토 = 24
• 1.1. 직접 면역형광염색법 = 24
• 1.2. PCR법을 이용한 C. pneumoniae 검출 = 24
• 2. 분리주의 C. pneumoniae 확인 = 29
• 2.1. PCR법을 이용한 C. pneumoniae 확인 = 29
• 2.2. 전자현미경 검경 = 29
• 2.3. 성장곡선 = 31
• 3. 분리주의 배양조건 확인 = 34
• 3.1. 세포주들의 비교 = 34
• 3.2. 숙주세포의 DEAE-dextran의 전처리 효과 = 34
• 3.3. Cycloheximide의 영향 = 37
• 3.4. 원심분리력과 원심분리 시간의 영향 = 37
• 3.5. FBS 농도의 영향에 따른 영향 = 37
• 4. C. pneumoniae LKK-1의 특성 = 44
• 4.1. 순수 분리된 EBs의 SDS-PAGE 양상분석 = 44
• 4.2. PCR-RFLP = 44
• 4.3. 유전자의 염기서열 분석 = 46
• Ⅳ. 고찰 = 59
• Ⅴ. 참고 문헌 = 70
• 영문 논문 제출서
• 영문 인준서
• ABSTRACT