아스파라지닐 엔도펩티데이즈를 이용한 펩타이드 라이게이션 = Peptide ligation using asparaginyl endopeptidase

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• 1. Peptide ligation 1
• 1) Asparaginyl endopeptidase(AEP) 1
• 2) Spyligase 6
• Ⅱ. 실험방법 및 재료 9
• 1. Plasmid 구축 9
• 1) AEP-mediated peptide ligation 9
• 2) Spyligase-mediated peptide ligation 10
• 3) Other enezymes 10
• 2. 균주 및 배양조건 13
• 3. 단백질 정제 및 저장 17
• 1) Phusion polymerase, T4 DNA ligase의 정제 및 저장19
• 2) 그 외 단백질 정제 및 저장 20
• Ⅲ. 결 과 21
• 1. OaAEP1 21
• 1) 단백질 정제 및 태깅 단백질 제거 21
• 2) LAD1 mutation을 통한 단일크기 mature form 생성 21
• 3) pH에 따른 Peptide ligation 효율성 차이 21
• 4) Mutant OaAEP1을 이용한 Cas9-RT single polypeptide
• 생성 22
• 2. Spyligase 31
• 1) 단백질 정제 및 태깅 단백질 제거 31
• 2) Spyligase를 이용한 sumo-MBP single polypeptide
• 생성 31
• 3) Citrate buffer를 이용에 따른 Cas9-RT single polypeptide 수용성 레벨 증가 31
• 3. Phusion polymerase 35
• 1) 단백질 정제 및 저장 35
• 2) 정제한 phusion polymerase 이용한 DNA 증폭 35
• 4. T4 DNA ligase 37
• 1) 단백질 정제 및 저장 37
• 2) 정제한 T4 DNA ligase를 이용한 DNA 연결 37
• 5. Ulp1 protease 39
• 1) Ulp1 protease 정제 및 기능확인 39
• 6. HRV3C protease 40
• 1) HRV3C protease 정제 및 기능확인 40
• 7. TEV protease 41
• 1) TEV protease 정제 및 기능확인 41
• Ⅳ. 결 론 42
• 1. OaAEP1 42
• 2. Spyligase 42
• Ⅴ. 토 의 44
• Ⅵ. 참고문헌 46