One-Pot Trehalose Production from Starch-Based Substrate Using Surface- Displayed ɑ-Amylase and Permeabilized Trehalose Synthase-Expressing Cells = 세포 표면 발현 ɑ-아밀레이스와 투과화 트레할로스 합성 세포를 이용한 전분계 기질의 단일 반응계 트레할로스 생산

국문 초록 (Abstract)

트레할로스는 우수한 안정화 능력과 생체적합성을 갖는 비환원성 이당류로서, 식품·화장품·의약품 등 다양한 제형에서 기능성 첨가제로 널리 사용된다. 그러나 현재 산업적 트레할로스 생산은 주로 전분 또는 말토덱스트린을 기질로 하는 maltooligosyl trehalose(MTSase/MTHase) 경로에 의존하고 있으며, 기질 특이성이 좁은 MTSase 특성 및 반응 중 축적되는 가지친 잔기와 저분자 부산물로 인해 정제 공정이 복잡해지고 전체 전환율이 제한되는 구조적 한계를 가진다. 이에 말토스와 트레할로스의 가역적 상호전환을 촉매하는 trehalose synthase(TreS)가 이러한 한계를 완화하고 생성물 조성을 단순화할 수 있는 대안적 생촉매로 주목받고 있다.
본 연구에서는 Pseudomonas putida KT2440을 숙주로 하여, 세포 표면에 디스플레이된 α‑아밀레이스와 투과 처리한 TreS 보유 세포를 기능적으로 결합함으로써 전분계 기질로부터 트레할로스를 단일 반응계 방식으로 생산하는 전세포 생촉매 시스템을 구축하였다. 이를 위해 Bacillus 유래 α‑아밀레이스를 Pseudomonas 외막 앵커 단백질인 ice nucleation protein(INPC) 및 OprF에 각각 융합한 INPC‑AmyE 및 OprF‑AmyE 표면 디스플레이 시스템을 구성하였고, 말토덱스트린의 가수분해를 통해 말토스가 생성됨을 확인함으로써 표면 발현을 입증하였다. 이후 pH, 온도, 기질 농도, 전세포 농도를 체계적으로 변화시키며 반응 조건을 최적화하여 두 앵커링 모티프의 촉매 성능을 정량 비교하고, 공업적 활용 가능성이 높은 시약 등급 및 식품 등급 말토덱스트린을 기질로 평가하였다.
말토덱스트린을 모델 기질로 수행한 동역학 분석 결과, 두 표면 디스플레이 시스템 모두 효율적인 말토스 생산을 보였으며, 기질 포화 조건에서 INPC‑AmyE가 OprF‑AmyE에 비해 전반적으로 더 높은 초기 반응 속도와 약간 우수한 단위 바이오매스당 촉매 생산성을 나타냈다. 다양한 기질 농도에서 얻은 시간 경과 데이터를 이용해 INPC‑AmyE 전세포 촉매의 겉보기 Michaelis–Menten 파라미터를 추정한 결과, 식품 등급 말토덱스트린은 시약 등급 기질에 비해 더 낮은 겉보기 K_m 값과 약간 감소한 V_max 값을 보여, 비교적 저렴한 식품 등급 기질을 사용하더라도 성능 저하 없이 공정에 적용할 수 있음을 시사하였다.
트레할로스 생성 단계를 구현하기 위해, 내인성 TreS를 보유한 야생형 P. putida KT2440 세포를 Tween 20으로 투과 처리하여 전세포 생촉매로 사용하였다. 계면활성제 농도, pH, 온도, 말토스 농도에 따른 트레할로스 생성성을 체계적으로 평가한 결과, pH 7.0 및 30 ℃에서 최적 활성이 관찰되었으며, 높은 기질 농도에서는 삼투 및 막 스트레스로 인해 트레할로스 농도와 전환율 사이에 상충 관계가 나타났다. 이러한 최적 조건에서 투과화 세포는 자가 고정화 효소 매트릭스가 제공하는 운전상의 장점을 유지하면서 말토스를 트레할로스로 효과적으로 전환하였다.
이어 두 반응 단계를 하나의 반응기에서 동시 운전하기 위해 INPC‑AmyE 표면 디스플레이 세포와 투과화된 TreS 세포를 혼합한 단일 연속 반응계를 구축하였다. 말토덱스트린 농도, 기질 등급, 투과화 세포:INPC‑AmyE 질량비를 변화시키며 평가한 결과, 트레할로스 생산성은 주로 투과화 세포의 투입량에 의해 지배되었으며, 저가의 식품 등급 말토덱스트린으로도 상당한 수준의 트레할로스 농도가 달성 가능함을 확인하였다. 가장 최적의 조건에서 단일 연속 반응계는 약 4 g/L의 트레할로스를 생성하였으며 트레할로스 전환율은 26.6%였다. 또한 트레할로스 합성을 α‑아밀레이스 촉매 반응과 결합함으로써, 표면 디스플레이된 α‑아밀레이스만 사용했을 때 약 40%였던 말토스 기준 겉보기 전체 전환율이 약 61%까지 증가하였다. 이러한 전환율 증가는 TreS에 의한 지속적인 말토스 소비가 α‑아밀레이스 주변의 생성물 축적을 완화하고, 단일 효소계에서 도달 가능한 평형을 넘어 말토덱스트린 가수분해를 진행시키는 ‘substrate‑pull’ 메커니즘과 일치한다. 또한 permeabilized cell:INPC‑AmyE 비율에 따른 생성물 분포 분석을 통해, 본 연구에서 설정한 조건하에서는 말토스에서 트레할로스로의 변환 단계가 전체 연속 반응에서 상대적으로 더 제한적인 구간을 이룸을 확인하였고, 이에 따라 TreS 활성 또는 permeabilized cell 성능을 표적 향상시키는 것이 전체 전환율을 추가로 끌어올릴 수 있는 전략임을 제시하였다.
종합하면, 본 연구는 세포 표면에서의 전분 가수분해와 세포 내 TreS 매개 이성화 반응을 결합한 통합 one‑pot 전세포 생촉매 시스템을 제시함으로써, 기존 MTSase/MTHase 기반 트레할로스 공정의 구조적 한계를 완화할 수 있는 기술적으로 실현 가능하고 경제성 잠재력이 높은 대안을 제시하였다. 이러한 플랫폼은 앵커링 모티프, TreS 효소 특성, 공정 운전 조건 등을 추가적으로 개선함으로써 보다 경제적이고 지속 가능한 트레할로스 바이오제조 공정으로 확장될 수 있으며, 향후 다양한 다단계 탄수화물 전환 반응에 적용 가능한 모듈형 one‑pot 전세포 촉매 시스템의 기반을 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Trehalose is a non-reducing disaccharide with excellent stabilizing properties and biocompatibility, which underlies its widespread use as a functional ingredient in food, cosmetic, and pharmaceutical formulations. Nevertheless, most industrial trehalose is still manufactured via the maltooligosyl-trehalose (MTSase/MTHase) pathway using starch or maltodextrin, a process intrinsically constrained by the narrow substrate specificity of MTSase and the concomitant accumulation of branched residues and low-molecular-weight by-products that complicate downstream purification and limit overall conversion. Trehalose synthase (TreS), which catalyzes the reversible interconversion of maltose and trehalose, has therefore attracted attention as a mechanistically distinct biocatalyst that could streamline product spectra and mitigate these limitations when embedded in appropriate process configurations. In this study, Pseudomonas putida KT2440 was engineered as a whole-cell biocatalyst for one-pot trehalose production from starch-based substrates by functionally coupling surface-displayed α-amylase with permeabilized TreS-containing cells. A Bacillus derived from α-amylase was genetically fused to two Pseudomonas outer membrane anchoring motifs, ice nucleation protein (INPC) and OprF, to generate INPC-AmyE and OprF-AmyE surface display systems, and successful presentation on the cell surface was confirmed through extracellular hydrolysis of maltodextrin to maltose. Reaction parameters for these surface-displayed biocatalysts were optimized with respect to pH, temperature, substrate concentration, and whole-cell loading, allowing quantitative comparison of anchoring motifs and assessment of reagent-grade versus food-grade maltodextrin as industrially relevant feedstocks. Kinetic analyses using maltodextrin as the model substrate demonstrated that both display systems supported efficient maltose formation, with INPC-AmyE generally affording higher initial reaction rates and slightly superior catalytic productivity per unit biomass than OprF-AmyE under substrate-saturating conditions. Time-course experiments at varying substrate levels enabled estimation of apparent Michaelis–Menten parameters for the INPC-AmyE whole-cell catalyst and showed that food-grade maltodextrin exhibited a lower apparent 𝐾𝑚 but a modestly reduced 𝑉𝑚𝑎𝑥 compared with reagent-grade material, indicating that low-cost food-grade substrates can be employed without substantial loss of performance. To implement the trehalose-forming step, wild-type P. putida KT2440 cells harboring endogenous TreS were permeabilized with Tween 20 and utilized as whole-cell biocatalysts. The effects of surfactant concentration, pH, temperature, and maltose concentration on trehalose formation were systematically evaluated, identifying near-neutral pH (7.0) and moderate temperature (30 ℃) as optimal and revealing a trade-off between trehalose titer and conversion at elevated substrate concentrations, most likely due to osmotic and membrane stress in permeabilized cells. Under these optimized conditions, the permeabilized cells converted maltose to trehalose while retaining the operational advantages of a self-immobilized enzyme matrix. The two reaction steps were subsequently integrated into a one-pot cascade by co-incubating INPC-AmyE surface-displayed cells with permeabilized TreS cells in a single reactor. Systematic variation of maltodextrin concentration, substrate grade, and the mass ratio of permeabilized cells to INPC-AmyE showed that trehalose productivity is governed primarily by the loading of permeabilized cells and that substantial trehalose titers can be obtained from inexpensive food-grade maltodextrin. Under the best conditions tested, the integrated system produced approximately 4 g/L trehalose with a trehalose conversion of 26.6%. In addition, coupling trehalose synthesis to α‑amylase catalysis increased the apparent overall maltose conversion to about 61%, compared with roughly 40% conversion obtained with the surface‑displayed α‑amylase alone. The enhanced conversion observed in the coupled system is consistent with a substrate-pull mechanism, whereby continuous consumption of maltose by TreS relieves product accumulation around α-amylase and drives maltodextrin hydrolysis beyond the equilibrium attainable in the single-enzyme configuration. Analysis of product distributions as a function of the permeabilized cell:INPC-AmyE ratio further indicates that, under the conditions examined, the maltose-to-trehalose step constitutes the relatively more limiting segment of the cascade, suggesting that targeted improvement of TreS activity or permeabilized-cell performance could yield additional gains in overall conversion. Collectively, this work establishes an integrated one-pot platform that couples cell-surface starch hydrolysis with intracellular TreS-mediated isomerization, providing a technically feasible and potentially more economical alternative to conventional MTSase/MTHase-based trehalose production and offering a versatile framework for future scale-up and process intensification of trehalose biomanufacturing.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 1.1 Trehalose: properties and applications 1
• 1.2 Industrial production of trehalose 4
• 1.3 Limitation of current starch-based processes and potential of TreS 7
• 1.4 Permeabilization 8
• 1.5 Cell surface display system 10
• 1.6 Objectives of this study 14
• 2. MATERIALS AND METHODS 17
• 2.1. Bacterial strains and plasmids 17
• 2.2. Culture and lyophilization 19
• 2.3. Whole cell biocatalytic reaction 20
• 2.4. Analytical methods 21
• 3. RESULTS AND DISCUSSION 23
• 3.1. Verification of surface display and permeabilized cells 23
• 3.2. Optimization of ɑ-amylase and permeabilization conditions 26
• 3.3. Kinetic characterization of INPC/OprF-AmyE 31
• 3.4. Measurement ɑ-amylase enzyme activity using starch-based substrate 37
• 3.5. Time profiles at different substrate concentrations 39
• 3.6. One-pot trehalose production 42
• 4. CONCLUSION 50
• REFERENCES 52
• 국문초록 57