혈액제제 생산공정 중 감염성 프리온 단백에 대한 안정성 인증시험 기반기술의 확립 및 프리온 단백항체 개발 = Developmental of antibodies for PrP detection and validation test on the removal of infectious prion protein during processes of the manufacture of human plasma products

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), or prion diseases, are a group of fatal neurodegenerative disorders of human and animals. In human, Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) is divided into four different forms; sporadic, familial, iatrogenic, and variant CJD. In case of iatrogenic CJD, infectious agent is transmitted to other people via CJD-contaminated surgical tools, injection of pituitary-derived hormones and dura mater transplantation from CJD-infected people, and so on. In addition, new variant CJD (vCJD) is believed to be resulted from the consumption of bovine spongiform encephalopathy (BSE)-infected beef. There is also growing concerns about the transmissibility of CJD via human plasma products. Therefore, it is necessary to devise reliable validation test for guaranteeing the safety of human plasma products and to produce effective anti-prion protein (PrP) antibodies for detecting prion agents more precisely. In this study, we performed validation test in the manufactural processes of human plasma products and demonstrated that infectious prion agents added in plasma was sufficiently reduced in the manufactural processes of immunoglobulin and albumin products using western blot analysis and bioassay. The developed 3F10 and 5B7 antibodies were prion protein-specific. 3F10 antibody recognizes the prion protein of hamster, mice and rat. And 5B7 antibody recognizes those of hamster, mice, human, bovine and deer. The epitopes of 3F10 and 5B7 antibodies were residues 137-145 and 97-125 of hamster prion protein, respectively.

국문 초록 (Abstract)

혈장으로 만드는 의약품은 수 많은 공혈자 혈장을 원료로 하여 생산되기 때문에 프리온 질환, 바이러스 등의 전염성 질환에 노출될 확률이 크다. 또한 최근 광우병에 걸린 소의 쇠고기 제품의 소비로인해 사람에서 발병가능성이 있는 새로운 변이형 CJD (new variant CJD, nvCJD)가 제안됨으로써 혈액제제에 의한 프리온 질환의 발병 원인체의 전염 가능성이 있기 때문에 혈액제제들로부터 감염성 프리온 단백을 제거시키는 공정이 확립되어져야 한다. 또한, 프리온 질환의 진단 기준의 확립을 위해 지금까지 개발된 프리온 단백에 대한 항체에 비해 감염성 프리온 단백에 대해 보다 특이적인 항체의 개발과 현존 항체의 검출한계를 극복하기 위한 극소량의 프리온 단백의 검출 기법의 개발이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 혈액제제 생산공정에서의 프리온 단백 제거검증을 위해 확보된 감염성 프리온단백을 Immunoglobulin과 Albumin 제제의 냉에탄올 분획 생산공정상에 첨가하고 이를 이용하여 감염성 프리온 단백의 제거여부를 검증하였으며, 극소량의 감염성 프리온 단백을 검출하기 위하여 PMCA (Misfolding Protein Cyclic Amplification) 증폭기법을 도용하여 소량의 감염성 프리온 단백을 검출하였다. 또한 이렇게 증폭기법으로 검출된 감염성 프리온 단백이 실제 검출 및 제거여부를 확립하기 위하여 웨스턴 블럿 및 생물학적 정량법을 실시하여 안전성 인증시험을 수행할 예정이다. 또한 정상 및 감염성 프리온 단백에 대한 특이적인 항체를 개발하였으며, 이들 3F10과 5B7 항체들의 epitope은 햄스터 PrP의 97-125과 137-145 아미노산 서열에 포함되어 있다. 앞으로 감염성 프리온 단백을 인지하는 항체를 개발하며 또한 극소량의 감염성 프리온 단백의 검출 기법을 확립하고자 한다.○ 연구목표 : 혈장으로 만드는 의약품은 수많은 공혈자 혈장을 원료로 하여 생산되기 때문에 프리온질환, 바이러스등의 전염성 질환에 노출될 확률이 크다. 또한 최근 광우병에 걸린 소의 쇠고기 제품의 소비로 인해 사람에서 발병가능성이 있는 새로운 변이형 CJD (new variant CJD, nvCJD)가 제안됨으로써 혈액제제에 의한 프리온 질환의 발병 원인체의 전염 가능성이 있기 때문에 혈액제제들로부터 감염성 프리온 단백을 제거시키는 공정이 확립되어져야 한다. 또한, 프리온 질환의 진단 기준의 확립을 위해 지금까지 개발된 프리온 단백에 대한 항체에 비해 감염성 프리온 단백에 대해 보다 특이적인 항체의 개발과 현존 항체의 검출한계를 극복하기 위한 극소량의 프리온 단백의 검출 기법의 개발이 필요하다.
○ 연구내용 : 혈액제제 생산공정에서의 프리온 단백 제거검증을 위해 확보된 감염성 프리온 단백을 Immunoglobulin과 Albumin 제제의 냉에탄올 분획 생산공정 상에 첨가하고 이를 이용하여 감염성 프리온 단백의 제거여부를 검증하며 극소량의 감염성 프리온 단백을 검출하기 위하여 PMCA (Misfolding Protein Cyclic Amplification) 증폭기법을 도용하여 소량의 감염성 프리온 단백을 검출한다. 또한 이렇게 증폭기법으로 검출된 감염성 프리온 단백이 실제 검출 및 제거여부를 확립하기 위하여 웨스턴 블럿 및 생물학적 정량법을 실시하여 안전성 인증시험을 수행한다. 또한 감염성 프리온 단백에 대한 보다 특이적인 항체를 개발 및 극소량의 감염성 프리온 단백의 검출 기법을 확립한다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 혈액제제 생산공정에서의 프리온 단백 제거검증를 위한 프리온 단백을 확보하였고 프리온 단백의 감염농도와 감염성 등의 생물학적 정량을 확립하였으며 프리온 단백에 대한 다클론 항체와 단일클론 항체를 성공적으로 생산하였다. 생산된 단일클론 항체는 기존의 항체에 비해 affinity나 titer에서도 뒤지지 않는 항체이다. 이를 바탕으로 혈액제제의 다른 공정상의 감염성 프리온 단백의 제거기술 개발 및 안정성 인증시험(validation test)을 위해 스크래피에 감염된 햄스터 뇌조직으로부터 프리온 단백을 분리하여 혈액제제 공정과정에 첨가함으로서 감염성 프리온 단백의 제거 여부를 확인하였으며 다른 공정상에서도 안전성 검증시험을 할 예정이며, 감염성 프리온 단백과 면역반응하는 특이적 항체를 이용하여 사람 및 동물의 프리온 질환을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 PMCA 기법의 도용을 통하여 매우 적은 량의 감염조직을 이용한 감염성 프리온 단백의 검출에 활용될 수 있을 것이다.