Effects of Spermidine Mediated Regulation of Hypusinated eIF5A on Mitochondrial Function Recovery and NAD+ Biosynthesis in Post-ovulatory Aged Oocytes = Spermidine에 의한 hypusinated eIF5A의 조절이 배란 후 노화된 난자의 미토콘드리아 기능 회복과 NAD+ 생합성에 미치는 영향

국문 초록 (Abstract)

배란 후 노화（post-ovulatory aging, POA）는 배란 후 수정이 지연될 때 발생하며, 돼지에서 미토콘드리아 기능 장애, NAD⁺ 합성 저하 및 이후 배아의 발달 능력 감소와 연관되어 보고되어 왔다. 그러나 여성 생식기 내에 풍부하게 존재하는 천연 폴리아민인 스퍼미딘（spermidine, Spd）이 POA 난자에 대한 항노화 효과는 아직 명확하게 규명되지 않았다. 본 연구에서는 Spd 보충이 POA 난자에서 NAD⁺ 합성, 미토콘드리아 기능 및 hypusinated eIF5A（eIF5AH）가 매개하는 유전자 발현을 조절함으로써 노화 관련 손상을 완화할 수 있는지를 조사하였다. 미성숙 돼지 난자는 체외에서 44시간 동안 성숙시킨 후 추가로 24시간 배양하여 POA를 유도하였다. Spd 처리 군은 동일한 조건에서 50 µM Spd를 첨가하여 배양하였다. 전사체 변화를 분석하기 위해 RNA sequencing（RNA-seq）을 수행하였으며, 체외성숙（IVM） 군과 POA 군 사이에서 총 304개의 차등 발현 유전자（fold change 〉 1.5）가 확인되었고, 이 중 115개는 상향 조절되고 189개는 하향 조절되었다. 미토콘드리아 기능, NAD⁺ 합성 및 eIF5AH 관련 유전자 발현은 면역형광 염색, Western blotting, qPCR을 통해 추가 평가하였다. Spd를 처리하지 않은 노화 난자와 비교했을 때, Spd가 처리된 POA 난자는 CLU（p 〈 0.01）, FAM111A（p 〈 0.001） 등 노화 관련 유전자의 발현이 유의하게 감소하였으며, ATP 생성（p 〈 0.05）, 미토콘드리아 막전위（ΔΨm; p 〈 0.05）, NAD⁺ 생합성（p 〈 0.01）이 회복되었다. 단백질 분석 결과, POA 난자에서는 eIF5A 및 hypusine 수준이 감소하고, 미토파지 활성화 지표인 LC3B 발현 또한 저하되었으나, Spd 보충에 의해 이러한 변화가 효과적으로 역전되었다. 결론적으로, Spd는 eIF5AH 활성을 증가시키고 POA 동안 발생하는 미토콘드리아 기능 장애 및 NAD⁺ 감소를 완화하며, 미토콘드리아 항상성과 난자 품질을 유지하는 데 기여함으로써 POA 난자의 효과적인 항노화 조절 인자로서의 잠재력을 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Post-ovulatory aging （POA） of oocytes occurs when fertilization is delayed after ovulation. This aging process has been associated with mitochondrial dysfunction, impaired NAD⁺ synthesis, and reduced developmental competence of subsequent embryos in pigs. However, the anti aging effects of spermidine （Spd） a natural polyamine abundant in the female reproductive tract on POA oocytes remain largely unclear. In present study, we investigated whether Spd supplementation alleviates aging related deterioration by regulating NAD⁺ synthesis, mitochondrial function, and hypusinated eIF5A （eIF5AH） mediated gene expression in POA oocytes. Immature porcine oocytes were matured in vitro for 44 hours and subsequently cultured for an additional 24 hours to induce post-ovulatory aging （POA）. The Spd treated group was cultured under the same conditions with the addition of 50 µM Spd for 24 hours. RNA sequencing （RNA-seq） was performed to examine transcriptomic changes, and 304 differentially expressed genes （fold change 〉 1.5） were identified between the IVM and POA groups, including 115 upregulated and 189 downregulated genes. Mitochondrial function, NAD⁺ synthesis, and eIF5AH related gene expression were further evaluated using immunofluorescence staining, Western blotting, and qPCR. Compared Spd with untreated aged oocytes, Spd treated POA oocytes showed significantly reduced expression of aging associated genes such as CLU （p 〈 0.01） and FAM111A （p 〈 0.001）, along with restored ATP production （p 〈 0.05）, mitochondrial membrane potential （ΔΨm; p 〈 0.05）, and NAD⁺ biosynthesis （p 〈 0.01）. Protein analysis revealed that eIF5A and hypusine levels were decreased in POA oocytes, and the expression of LC3B, an indicator of mitophagy activation, was also reduced; however, Spd supplementation effectively reversed these alterations. In conclusion, Spd enhances eIF5AH activity, mitigates mitochondrial dysfunction and NAD⁺ decline during POA, and preserves mitochondrial integrity and oocyte quality, suggesting its potential as an effective anti aging modulator in post-ovulatory oocytes.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 5
• 1. Chemicals and animals 5
• 2. Porcine oocyte collection and in vitro maturation （IVM） 5
• 3. In vitro aging and Spd treatment 6
• 4. RNA sequencing （RNA-seq） analysis 6
• 5. Measurement of perivitelline space （PVS） 7
• 6. Immunofluorescence 7
• 7. Fluorescent staining 8
• 8. Quantitative PCR （qPCR） 9
• 9. Western blot analysis 10
• 10. Quantification of cellular ATP content 10
• 11. Quantification of Intracellular and Plasma NAD⁺ Levels 11
• Ⅲ. RESULTS 13
• 1. RNA-seq transcriptome profiling and DEG analysis following Spd supplementation 13
• 2. Spd supplementation modulates aging related genes and preserves cytoskeletal organization 16
• 3. Spd supplementation alleviates mitochondrial dysfunction and apoptosis 19
• 4. Spd supplementation restores NAD⁺ biosynthesis and SIRT1 expression 22
• 5. Spd supplementation upregulates eIF5Aᴴ associated proteins and supports mitophagy signaling 25
• Ⅳ. DISCUSSION 30
• REFERENCES 35
• ABSTRACT 40