ATF5-related UPRmt Response is Associated with GRP75-dependent ER–mitochondria Signaling in Heat-stressed Bovine Oocytes = 고온 스트레스 유래 소 난자에서 ATF5 관련 UPRmt 반응과 GRP75 의존성 ER-미토콘드리아 신호전달과 연관성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Heat stress （HS） is a major environmental factor that impairs livestock fertility by reducing oocyte quality and embryonic developmental competence. However, the mitochondrial stress responses associated with HS during bovine oocyte in vitro maturation （IVM） remain incompletely understood. This study investigated whether HS during IVM affects bovine oocyte maturation and subsequent embryonic development in association with ATF5-related mitochondrial unfolded protein response （UPRmt） and GRP75-associated ER–mitochondria signaling. Bovine cumulus–oocyte complexes were matured for 22 h at 38.5°C （control） or 41.5°C （HS）, followed by in vitro fertilization （IVF） and culture （IVC） under standard conditions. HS exposure increased GRP75 and ATF5 immunoreactivity in ovarian follicular oocytes. During IVM, HS impaired cumulus expansion, reduced the proportion of MII-stage oocytes, and increased abnormal spindle morphology and chromosome misalignment. HS-exposed oocytes also exhibited increased mitochondrial ROS production, reduced mitochondrial membrane potential （MMP）, increased nuclear localization of ATF5, elevated GRP75 expression, and increased Rhod-2 fluorescence. Transcriptomic analysis identified 724 differentially expressed genes, including genes associated with mitochondrial membranes, mitochondrial translation, respiratory chain assembly, and MMP regulation. In addition, qPCR analysis showed altered expression of UPRmt-related genes, including LONP1, HSPD1, HSPA9, and ATF5. The adverse effects of HS during IVM persisted during subsequent embryonic development, as shown by reduced cleavage and blastocyst formation rates, decreased proportions of late and expanded blastocysts, reduced blastocyst diameter, increased apoptosis, and persistent mitochondrial dysfunction. Furthermore, ATF5-related responses, increased GRP75 expression, and elevated Rhod-2 fluorescence were observed at the cleavage and blastocyst stages. These findings suggest that HS during bovine oocyte maturation induces persistent mitochondrial dysfunction and is associated with ATF5-related UPRmt responses and GRP75-associated ER–mitochondria signaling. Collectively, this study provides insight into the mitochondrial stress mechanisms underlying HS-induced impairment of bovine oocyte maturation and embryonic development.

국문 초록 (Abstract)

고온 스트레스（HS）는 난모세포의 질과 배아 발달능을 저하시켜 가축의 번식 효율을 감소시키는 주요 환경적 요인이다. 그러나 소 난모세포의 체외성숙（IVM） 과정에서 HS에 의해 유도되는 미토콘드리아 스트레스 반응은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 IVM 과정 중 HS가 소 난모세포의 성숙 및 이후 배아 발달에 미치는 영향을 확인하고, 이러한 변화가 ATF5 관련 미토콘드리아 미접힘 단백질 반응（UPRmt）과 GRP75 관련 ER–미토콘드리아 신호전달과의 상관관계를 조사하였다. 소 난구세포–난모세포 복합체를 38.5°C 대조군 또는 41.5°C HS 조건에서 22시간 동안 성숙시킨 후, 동일한 조건에서 체외수정（IVF） 및 체외배양（IVC）을 진행하였다. HS 조건에서 난소 난포 내 난모세포에서 GRP75 및 ATF5 단백질 발현이 증가하였다. 체외성숙 단계에서 HS는 난구세포 확장을 저해하고, MII 단계 난모세포 비율을 감소시켰으며, 비정상적인 방추사 구조와 염색체 배열 이상을 증가시켰다. 또한, HS에 노출된 소 난모세포에서는 미토콘드리아 ROS 생성 증가, 미토콘드리아 막전위 감소, ATF5 위치 변화, GRP75 발현 증가 및 Rhod-2 형광 증가가 관찰되었다. 전사체 분석 결과, 미토콘드리아 막, 미토콘드리아 번역, 호흡사슬 조립 및 미토콘드리아 막전위 조절과 관련된 유전자를 포함하여 총 724개의 차등 발현 유전자들이 확인되었다. 또한, qPCR 분석에서 LONP1, HSPD1, HSPA9 및 ATF5를 포함한 UPRmt 관련 유전자의 발현 변화가 확인되었다. 난모세포의 체외성숙 중 유도된 HS의 영향은 이후 배아 발달 단계까지 지속되었으며, 난할률 및 배반포 형성률 감소, late 및 expanded 배반포 비율 감소, 배반포 직경 감소, 세포사멸 증가 및 지속적인 미토콘드리아 기능장애로 나타났다. 또한, 난할 단계와 배반포 단계에서 ATF5 관련 반응, GRP75 발현 증가 및 Rhod-2 형광 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 소 난모세포 성숙 과정 중 HS가 지속적인 미토콘드리아 기능장애를 유도하며, 이는 ATF5 관련 UPRmt 반응 및 GRP75 관련 ER–미토콘드리아 신호전달과 연관되어 있음을 시사한다. 종합적으로 본 연구는 HS에 의한 소 난모세포 성숙 및 배아 발달 저하의 미토콘드리아 스트레스 기전에 대한 이해를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 4
• 1. Chemicals 4
• 2. In vitro maturation （IVM） 4
• 3. In vitro production （IVP） of bovine embryos 4
• 4. Experimental design 5
• 5. Immunohistochemistry （IHC） 7
• 6. Assessment of meiotic maturation by orcein staining 9
• 7. Immunofluorescence （IF） staining 9
• 8. Fluorescent staining （MitoTracker Orange, JC-1, Mito-SOX Red, Rhod-2） 10
• 9. TUNEL assay 10
• 10. RNA sequencing （RNA-seq） analysis 11
• 11. Quantitative real-time PCR （qPCR） 12
• 12. Statistical analysis 14
• Ⅲ. RESULTS 15
• 1. HS increases GRP75 and ATF5 expression in ovarian follicular oocytes 15
• 2. Oocytes exposed to HS during IVM exhibit impaired maturation and abnormal spindle organization 17
• 3. HS during IVM induces mitochondrial dysfunction in bovine oocytes 19
• 4. HS enhances ATF5-related mitochondrial stress response and GRP75-associated Ca²⁺ alterations in oocytes 21
• 5. HS during IVM alters mitochondrial stress and UPRmt-related gene expression in bovine oocytes 23
• 6. HS alters ATF5/GRP75-associated mitochondrial stress pathways in bovine oocytes 25
• 7. HS during IVM reduces cleavage rate and alters UPRmt-related gene expression at the cleavage stage 27
• 8. HS-induced ATF5-related response is associated with GRP75 and Ca²⁺ alterations at the cleavage stage 29
• 9. HS during IVM impairs blastocyst development and alters UPRmt-related gene expression 31
• 10. HS during IVM increases apoptosis in blastocysts 33
• 11. HS during IVM induces mitochondrial dysfunction in blastocysts 35
• 12. HS during IVM is associated with persistent ATF5-related responses and GRP75/Ca²⁺ alterations in blastocysts 37
• Ⅳ. DISCUSSION 40
• REFERENCES 44
• ABSTRACT 47