내열성 효소 단백질 창출을 위한 Bacillus, streptomyces 및 벼 α-amylase 유전자 Clone의 비교 분석 = Comparative analysis of αamylase gene clones from bacillus, streptomyces and rice for the production of thermostable enzyme

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 총괄과제 「내열성 효소 단백질 창출을 위한 Bacillus, Streptomyces 및 벼α-amylase 유전자 Clone의 비교 분석」
• 1. 서론 = 19
• 2. 연구방법 = 21
• 제1장 제1 세부과제 = 21
• 제1절 벼 α-amylase 유전자 클로닝을 위한 Probe DNA의 확보 = 21
• 1. 벼 genomic DNA와 Bacillus licheniformis α-amylase 간의 상동성 조사 = 21
• 제2절 식물 α-amylase 유전자의 deoxyoligonucleotide 합성 = 21
• 1. Deoxyoligonucleotide 설계, 합성 및 정제 = 21
• 2. 벼 genomic DNA와의 상동성 조사 = 22
• 제3절 벼 호분층의 cDNA 유전자 은행 작성 = 22
• 1. 호분층 분리 및 배양 = 23
• 2. 호분층으로부터의 RNA 분리 = 23
• 가. Guanidinium/hot phenol method에 의한 total RNA분리 = 23
• 나. Oligo(dT)-cellulose column chromatography에 의한 mRNA 분리 = 23
• 3. cDNA library 작성 = 23
• 가. cDNA 합성 = 24
• 나. cDNA 정제 = 24
• 다. Adaptor ligation 및 kination = 24
• 라. Ligation of cDNA with λgt 11 arms and in vitro packaging = 25
• 제4절 cDNA library screening = 25
• 1. Iodine test를 이용한 cDNA library screening = 26
• 2. Plaque hybridization를 이용한 cDNA library screening = 26
• 3. PCR을 이용한 cDNA library screening = 26
• 제5절 PCR을 이용한 α-amylase의 direct cloning = 27
• 1. Oligonucleotide의 설계, 합성 및 정제 = 27
• 2. PCR에 의한 full length α-amylase 유전자의 cloning = 27
• 3. Ligation 반응 및 E.coli 내로의 transformation = 27
• 4. Plasmid DNA의 분리 및 정제 = 27
• 제6절 α-Amylase 유전자의 sequencing = 28
• 제7절 α-Amylase 유전자의 구조 및 발현 = 28
• 1. 유전자의 구조 = 28
• 가. Probe 준비 = 28
• 나. Genomic DNA의 분리 = 29
• 다. Genomic DNA digestion = 29
• 라. Southern blot analysis = 30
• 2. Northorn hybridization 및 RT/PCR = 30
• 가. Northern hybridization = 30
• 나. RT/PCR = 31
• 제2장 제2 세부과제 = 32
• 제1절 α-Amylase의 생산 및 정제 = 32
• 1. 사용 균주 및 배지 = 32
• 2. 형질 전환 = 32
• 3. 효소의 생산 = 33
• 4. 효소의 분리 정제 = 33
• 제2절 Immunoaffinity chromatography = 34
• 1. α-amylase의 antibody 제조 = 35
• 2. Immunoadsorbent의 제조 = 35
• 3. Immunoaffinity chromatography = 37
• 제3절 α-amylase gene의 DNA 염기 서열 결정 = 37
• 1. Single stranded DNA 제조 = 37
• 2. Sequencing = 37
• 제4절 Modified α-amylase의 제조 = 38
• 제3장 제3 세부 연구과제 = 38
• 제1절 Amylase 생산성 방선균의 분리와 선별 = 38
• 제2절 Amylase 생산균주의 동정 = 39
• 1. 세포벽 구성성분의 분석 = 39
• 2. 형태적 특징 및 성장 생리 특성 = 40
• 제3절 선발균주에 의한 Amylase 의 정제 = 40
• 1. 효소의 생산조건 = 41
• 2. 효소의 정제 = 41
• 3. 효소의 역가 측정 = 41
• 4. 단백질 농도 측정 = 42
• 제4절 아밀라제 유전자의 클로닝 = 42
• 1. 균주 및 plasmid = 42
• 2. Total DNA의 분리 = 42
• 3. Plasmid DNA의 분리 및 정제 = 43
• 4. Amylase gene cloning 및 E. coli의 형질전환 = 43
• 5. DNA-restriction enzyme mapping = 43
• 제5절 형질전환된 대장균이 생산하는 아밀라제의 특성 = 44
• 1. Crude Enzyme의 분리 = 44
• 2. SDS-PAGE와 amylase activity 확인 = 44
• 3. Amylase역가 측정 = 45
• 4. TLC와 HPLC을 이용한 반응 생산물의 성분분석 = 45
• 3. 결과 = 46
• 제1장 제1 세부과제 = 46
• 제1절 벼 α-amylase 유전자 cloning을 위한 probe DNA의 확보 = 46
• 1. 벼 genomic DNA와 Bacillus 1. α-amylase 간의 상동성 조사 = 46
• 2. 식물 α-amylase 유전자의 deoxyoligonucleotide 합성 = 46
• 가. Deoxyoligonucleotide 설계, 합성 및 정제 = 47
• 나. 벼 genomic DNA와의 상동성 조사 = 47
• 제2절 벼 호분층의 cDNA 유전자 은행 작성 = 47
• 1. 호분층의 분리 및 배양 = 47
• 2. 호분층으로부터의 RNA 분리 = 48
• 가. Total RNA 및 mRNA의 분리 = 48
• 나. Northern hybridization analysis = 48
• 제3절 cDNA library 작성 = 48
• 제4절 cDNA library screening = 49
• 1. Ioding test를 이용한 cDNA library screening = 49
• 2. Plaque hybridization를 이용한 cDNA library screening = 49
• 3. PCR을 이용한 cDNA library screening = 50
• 제5절 PCR을 이용한 α-amylase의 direct 클로닝 = 50
• 1. Oligonucleotide의 설계, 합성 및 정제 = 50
• 2. PCR에 의한 full length α-amylase 유전자의 클로닝 = 51
• 3. Ligation 반응 및 E.coli내로의 transformation = 51
• 4. Insert 확인 = 51
• 제6절 α-Amylase 유전자의 sequencing = 52
• 제7절 α-Amylase 유전자의 구조 및 발현 = 52
• 1. Southern blotting = 52
• 2. PCR를 이용한 α-amylase 유전자의 발현 검정 = 53
• 제2장 제 2세부과제 = 54
• 제1절 α-amylase 의 분리, 정제 = 54
• 제2절 Antibody의 제조 = 54
• 제3절 Immunoaffinity chromatography = 55
• 제4절 Immunoblotting 및 Southern blotting analysis = 55
• 제5절 DNA 염기 서열 = 56
• 1. 내열성 α-amylase 유전자의 염기서열 = 56
• 2. 아미노산 조성 = 57
• 3. Codon usage = 57
• 4. Signal peptide = 58
• 제6절 Modified α-amylase 의 제조 = 58
• 1. 특수 product 생산성 amylase의 제조 = 58
• 2. Modified α-amylase의 효소적 특성 = 59
• 3. Modified α-amylase의 action pattern = 59
• 제3장 제 3 세부과제 = 60
• 제1절 균주의 선별 = 60
• 1. 1차 선별 = 60
• 2. 2차 선별 = 60
• 제2절 선별 균주의 동정 = 60
• 제3절 효소의 정제 및 특성 = 71
• 1. 효소의 정제 = 61
• 2. Streptomyces KSM-35 amylase의 작용유형 = 61
• 3. 온도와 pH가 Streptomyces KSM-35 amylase 활성에 미치는 영향 = 62
• 4. 몇가지 저해제가 Streptomyces KSM-35 amylase 활성에 미치는 영향 = 62
• 5. Streptomyces KSM-35의 amylase의 등전점 측정 = 62
• 6. Streptomyces KSM-35의 amylase의 분자량 측정 = 62
• 7. Streptomyces KSM-35 amylase 의 전분 분해도 = 63
• 8. 전분 가수분해 산물의 분석 = 63
• 제4절 Streptomyces sp. KSM-35의 amylase 유전자 = 63
• 1. Amylase gene의 cloning = 63
• 2. Amylase 유전자의 restriction enzyme mapping = 64
• 제5절 형질전환된 E. coli에서 생산된 amylase 의 특성 = 64
• 1. E.coli에서 amylase의 세포내 분포에 따른 activity 측정 = 64
• 2. SDS-PAGE을 이용한 amylase activity의 확인 = 65
• 3. 반응 최적 온도 = 65
• 4. 열 안정성 = 66
• 5. 반응 최적 pH = 66
• 6. 효소의 전분 가수 분해 산물의 TLC 및 HPLC에 의한 분석 = 66
• 4. 고찰 = 68
• 제1장 제1 세부과제 = 68
• 제1절 벼 α-amylase 유전자 클로닝을 위한 probe DNA의 확보 = 68
• 제2절 cDNA 유전자 은행의 작성 및 α-amylase cDNA clone의 선발 = 68
• 제3절 PCR을 이용한 α-amylase유전자의 direct 클로닝 = 70
• 제4절 α-Amylase 유전자의 염기서열 분석 = 70
• 제5절 벼 α-amylase 유전자의 구조 및 발현 = 71
• 제2장 제2 세부과제 = 73
• 제3장 제3 세부과제 = 77
• 제1절 균주의 선별 = 78
• 제2절 선별 균주의 동정 = 78
• 제3절 효소의 정제 및 특성 = 79
• 제4절 Streptomyces sp. KSM-35의 amylase 유전자 = 79
• 제5절 형질전환된 E. coli에서 생산된 amylase의 특성 = 79
• 5. 결론 = 81
• 6. 참고문헌 = 85
• 제1세부과제 벼 α-amylase의 유전자 cloning 및 그 분자생물학적 연구
• 1. 서론 = 95
• 2. 연구방법 = 98
• 제1장 벼 α-amylase 유전자 클로닝을 위한 probe DNA의 확보 = 98
• 제1절 벼genomic DNA와 Bacillus 1. α-amylase 간의 상동성 조사 = 98
• 제2절 식물 α-amylase 유전자의 deoxyoligonucleotide 합성 = 98
• 1. Deoxyoligonucleotide 설계, 합성 및 정제 = 98
• 2. 벼 genomic DNA와의 상동성 조사 = 100
• 제2장 벼 호분층의 cDNA 유전자 은행 작성 = 102
• 제1절 호분층 분리 및 배양 = 102
• 제2절 호분층으로부터의 RNA 분리 = 102
• 1. Guanidinium/hot phenol method에 의한 total RNA분리 = 102
• 2. Oligo(dT)-cellulose column chromatography를 이용한 mRNA 분리 = 103
• 제3절 cDNA library 작성 = 104
• 1. cDNA 합성 = 104
• 2. cDNA 정제 = 105
• 3. Adaptor ligation 및 kination = 105
• 4. Ligation of cDNA with λgt 11 arms and in vitro packaging = 106
• 제3장 cDNA library screening = 108
• 제1절 Iodine test를 이용한 cDNA library screening = 108
• 제2절 Plaque hybridization를 이용한 cDNA library screening = 108
• 제3절 PCR을 이용한 cDNA library screening = 109
• 제4장 PCR을 이용한 α-amylase의 direct cloning = 110
• 제1절 Oligonucleotide의 설계, 합성 및 정제 = 110
• 제2절 PCR에 의한 full length α-Amylase 유전자의 구조 및 발현 = 110
• 제3절 Ligation 반응 및 E.coli내로의 transformation = 110
• 제4절 Plasmid DNA의 분리 및 정제 = 111
• 제5장 α-Amylase 유전자의 Sequencing = 113
• 제1절 Single Strand DNA의 제조 = 113
• 제2절 DNA Sequencing = 113
• 제6장 α-Amylase 유전자의 구조 및 발현 = 114
• 제1절 Southern blotting = 114
• 1. Probe DNA 준비 = 114
• 2. Genomic DNA의 분리 = 115
• 3. Genomic DNA digestion = 115
• 4. Southern blot analysis = 115
• 제2절 Northern blot analysis 및 RT/PCR = 115
• 1. Northern blotanalysis = 115
• 2. RT/PCR = 116
• 3. 결과 = 117
• 제1장 벼 α-amylase 유전자 클로닝을 위한 probe DNA의 확보 = 117
• 제1절 벼와 Bacillus licheniformis α-amylse간의 상동성 조사 = 117
• 제2절 식물 α-amylase 유전자의 deoxyoligonucleotide 합성 = 117
• 1. Deoxyoligonucleotide 설계, 합성 및 정제 = 117
• 2. 벼 genomic DNA와의 상동성 조사 = 118
• 제2장 벼 호분층의 cDNA 유전자 은행 작성 = 120
• 제1절 호분층의 분리 및 배양 = 120
• 제2절 호분층으로부터의 RNA 분리 = 120
• 1. Total RNA 및 mRNA의 분리 = 120
• 2. Northern hybridization analysis = 123
• 제3절 cDNA library 작성 = 123
• 제3장 cDNA library screening = 128
• 제1절 Iodine test를 이용한 cDNA library screening = 128
• 제2절 Plaque hybridization를 이용한 cDNA library screening = 128
• 제3절 PCR을 이용한 cDNA library screening = 130
• 제4장 PCR을 이용한 α-amylase의 direct 클로닝 = 132
• 제1절 Oligonucleotide의 설계, 합성 및 정제 = 132
• 제2절 PCR에 의한 full length α-amylase 유전자의 클로닝 = 133
• 제3절 Ligation 반응 및 E.coli내로의 transformation = 133
• 제4절 Insert 확인 = 133
• 제5장 α-Amylase 유전자의 sequencing = 138
• 제6장 α-Amylase 유전자의 구조 및 발현 = 142
• 1. Southern blotting = 142
• 2. Northern blot analysis 및 RT/PCR = 142
• 4. 고찰 = 148
• 제1장 벼 α-amylase 유전자 클로닝을 위한 probe DNA의 확보 = 148
• 제2장 cDNA 유전자 은행의 작성 및 α-amylase cDNA clone의 선발 = 149
• 제3장 PCR을 이용한 α-amylase유전자의 direct 클로닝 = 152
• 제4장 α-Amylase 유전자의 염기서열 분석 = 154
• 제5장 벼 α-amylase 유전자의 구조 및 발현 = 155
• 5. 결론 = 157
• 6. 참고문헌 = 159
• 제2부 세부과제 「내열성 세균 α-amylase gene을 이용한 효소의 특성 연구 및 정제 기술 개발」
• 1. 서론 = 169
• 2. 연구방법 = 172
• 제1장. α-amylase의 생산 및 정제 = 172
• 제1절 사용 균주 및 배지 = 172
• 1. 사용 균주 및 배지 = 172
• 2. 형질 전환 = 172
• 제2절 연구목적 = 172
• 제3절 효소의 생산 = 173
• 제4절 효소의 분리 정제 = 174
• 제2장 Immunoaffinity chromatography = 177
• 1. α-amylase의 antibody 제조 = 177
• 2. Immunoadsorbent의 제조 = 179
• 3. Immunoaffinity chromatography = 179
• 제3장 α-amylase gene의 DNA 염기 서열 결정 = 181
• 제1절. Single stranded DNA 제조 = 181
• 제2절. Sequencing = 181
• 제4장 Modified α-amylase의 제조 = 182
• 3. 결과 = 184
• 제1장. α-amylase의 분리, 정제 = 184
• 제2장. Antibody의 제조 = 191
• 제3장. Immunoaffinity chromatography = 193
• 제4장. Immunoblotting 및 Southern blotting analysis = 198
• 제5장. DNA 염기서열 = 202
• 제1절. 내열성 α-amylase 유전자의 염기서열 = 202
• 제2절. 아미노산 조성 = 202
• 제3절. Codon usage = 213
• 제4절. Signal peptide = 213
• 제6장. Modified α-amylase의 제조 = 219
• 제1절. 특수 product 생산성 amylase의 제조 = 219
• 제2절. Modified α-amylase의 효소적 특성 = 223
• 제3절. Modified α-amylase의 action pattern = 223
• 4. 고찰 = 227
• 5. 결론 = 232
• 6. 참고문헌 = 233
• 제3 세부과제
• 1. 서론 = 243
• 2. 연구방법 = 246
• 제1장 Amylase 생산성 방선균의 분리와 선별 = 246
• 제2장 Amylase 생산균주의 동정 = 247
• 제1절 세포벽 구성성분의 분석 = 247
• 제2절 형태적 특징 및 성장 생리 특성 = 250
• 제3장 선발균주에 의한 Amylase의 정제 = 251
• 제1절 효소의 생산 조건 = 251
• 제2절 효소의 정제 = 251
• 제3절 효소의 역가 측정 = 253
• 제4절 단백질 농도 측정 = 253
• 제4장 아밀라제 유전자의 클로닝 = 254
• 제1절 균주 및 plasmid = 254
• 제2절 시약 및 제한효소 = 254
• 제3절 배지 = 255
• 제4절 Total DNA의 분리 = 255
• 제5절 Plasmid DNA의 분리 및 정제 = 256
• 제6절 Amylase gene cloning 및 E. coli의 형질전환 = 257
• 제7절 DNA-restriction enzyme mapping = 259
• 제5장 형질전환된 대장균이 생산하는 아밀라제의 특성 = 260
• 제1절 Crude Enzyme의 분리 = 260
• 제2절 SDS-PAGE와 amylase activity 확인 = 260
• 제3절 Amylase역가 측정 = 261
• 제4절 TLC와 HPLC을 이용한 반응 생산물의 성분분석 = 261
• 3. 결과 = 263
• 제1장 균주의 선별 = 263
• 제1절 1차 선별 = 263
• 제2절 2차 선별 = 263
• 제2장 선별 균주의 동정 = 265
• 제3장 효소의 정제 및 특성 = 270
• 제1절 효소의 정제 = 270
• 제2절 Streptomyces KSM-35의 amylase의 작용유형 = 270
• 제3절 온도와 PH가 Streptomyces KSM-35의 amylase 활성에 미치는 영향 = 275
• 제4절 몇가지 저해제가 Streptomyces KSM-35의 amylase 활성에 미치는 영향 = 275
• 제5절 Streptomyces KSM-35의 amylase의 등전점 측정 = 280
• 제6절 Streptomyces KSM-35의 amylase의 분자량 측정 = 280
• 제7절 Streptomyces KSM-35의 amylase의 전분 분해도 = 280
• 제8절 전분 가수분해 산물의 분석 = 284
• 제4장 Streptomyces sp. KSM-35의 amylase 유전자 = 286
• 제1절 Amylase gene의 cloning = 286
• 제2절 Amylase 유전자의 restriction enzyme mapping = 286
• 제5장 형질전환된 E. coli에서 생산된 amylase 의 특성 = 292
• 제1절 E.coli에서 amylase의 세포내 분포에 따른 activity 측정 = 292
• 제2절 SDS-PAGE을 이용한 amylase activity의 확인 = 294
• 제3절 반응 최적 온도 = 294
• 제4절 열 안정성 = 296
• 제5절 반응 최적 pH = 296
• 제6절 효소의 전분 가수 분해 산물의 TLC 및 HPLC에 의한 분석 = 299
• 4. 고찰 = 303
• 제1장 균주의 선별 = 303
• 제2장 선별 균주의 동정 = 303
• 제3장 효소의 정제 및 특성 = 306
• 제4장 Streptomyces sp. KSM-35의 amylase 유전자 = 309
• 제5장 형질전환된 E. coli에서 생산된 amylase의 특성 = 311
• 5. 결론 = 314
• 6. 참고문헌 = 316