혈소판융해물의 제조와 미생물 증식 및 인간유래세표 증식에 미치는 효과에 관한 연구 = (The) studies for the preparation of platelet lysate(PL) and the effects of platelet lysate(PL) on the proliferations for microbial and the human derived cells

국문 초록 (Abstract)

혈소판(Platelet)이 성장인자들을 방출 한다는 것이 알려진 이후로 상처치유와 재생 치료 분야를 포함한 다양한 의료 분야에서 혈소판풍부혈장(platelet rich plasma, PRP)을 이용한 연구 결과들이 보고되고 있다. 이중 활성화된 PRP는 항균 효과가 있다고 보고되고 있고, 혈소판을 활성화시킨 혈소판융해물(platelet lysates, PL)은 세포 배양 시 배지에 첨가하는 fetal bovine serum (FBS)의 대체 물질로서의 가능성이 제기되고 있다. 본 연구자는 냉해동 시킨 액상의 활성화된 PRP에서 얻어진 PL이 미생물 증식에 미치는 효과를 관찰하기 위해, 항균 효과 여부를 관찰하고, 인간유래세포 증식에 미치는 효과를 조사하여 세포 배양에 적합한 최적의 PL제조 조건을 제시하고자 하였다.
PL의 항균효과 조사를 위하여 건강한 자원자 20명으로부터 얻어진 혈액에서 PRP를 분리하였다. 이를 냉해동(freezing-thawing, FT)후 트롬빈으로 활성화하고 헤파린으로 처리하여 PL를 제조한 후 Staphylococcus aureus (S. aureus) 와 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)에 대한 항균효과를 디스크확산법과 직접 집적법 등을 이용하여 실험하였다. 실험은 이중맹검 방식으로 수행하였다. 세포 배양 시에 FBS를 대체할 수 있는 최적의 PL 제조 조건을 확립하기 위해 PRP의 냉해동 횟수, 혈소판 수와 배양 시 PL 농도의 조건 등을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 농축혈소판(platelet concentrates, PC)으로부터 혈소판 수를 1 × 109/mL과 2 × 109/mL으로 맞춘 PRP를 만들고 이의 냉해동 횟수는 1-3회까지 조건을 달리하면서 PL을 제조하여 실험에 이용하였다. 세포주는 인간유래세포인 HaCaT 세포주를 사용하였고, PL의 농도는 5%와 10%로 구분하고 계대배양 횟수도 1-3회까지 조절하면서 변화 여부를 관찰하였다. 세포수 산정은 cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였고, PL로부터 유래된 성장인자는 luminexTM 200 system (Millipore Corporation, Austin, TX, U.S.A.)을 이용하여 측정하였다.
트롬빈으로 활성화하고 헤파린으로 처리한 PL의 S. aureus와 P. aeruginosa에 대한 항균효과는 디스크확산법과 직접 집적법의 방법에서 억제대 지름이 각각 0 mm로 측정되어, 제조된 PL의 항균효과는 없었다. 세포 배양용으로 제조된 PL은 5% PL군이 10% PL군에 비하여 유의하게 세포수 증식이 많았는데, 특히 1 × 109/mL PL군에서 유의한 차이를 보였다(P<0.001). 5% PL군은 2회 냉해동시, 계대배양 횟수는 3회일 때 HaCaT 세포가 가장 많이 증식되었다. 제조한 PL의 성장인자 농도 측정 시 vascular endothelial growth factor (VEGF) (P<0.001), platelet-derived growth factor-AB/BB (PDGF-AB/BB) (P<0.001), PDGF-AA(P=0.01), epidermal growth factor (EGF) (P<0.001)는 2 × 109/mL PL군이 1 × 109/mL PL군에 비하여 유의하게 높았으며(P<0.001), 오직VEGF 와 PDGF-AA만이 이들의 농도와 세포 수 증식과의 연관성을 보이는 소견을 관찰할 수 있었다.
결론적으로 본 연구에서 제조한 PL은 S. aureus와 P. aeruginosa에 대한 항균효과는 없었다. 그 원인을 규명하기 위한 보다 깊이 있는 연구가 추가적으로 필요하다. 본 연구자가 세포 배양용으로 제조한 PL은 HaCaT 세포주 배양 시 FBS 를 대체할 수 있었으며, 2회 냉해동한 5% 1 × 109/mL PL군이 가장 효율이 우수하였다. 추가 연구를 통해 다양한 세포에서의 대체 가능성을 확인할 필요가 있을 것이다.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약 i
• 차례 iii
• 그림차례 iv
• 표차례 v
• I. 서론 1
• II. 연구대상 및 방법 3
• A. 연구대상 3
• 1. PL의 항균효과 대상 3
• 2. 세포배양용 PL 제조 대상 4
• B. 방법 5
• 1. PL의 항균효과 검증 방법 5
• 2. PL제조 조건이 세포배양에 미치는 효과 12
• III. 결과 17
• A. PL의 항균효과 검증 방법 17
• B. PL 제조 조건이 세포배양에 미치는 효과 20
• 1. PL제조용 농축혈소판 특징 20
• 2. PL의 냉해동 횟수에 따른 혈소판 수 차이 21
• 3. PL의 농도와 냉해동 횟수가 HaCaT 세포에 미치는 영향 23
• 4. 계대배양 횟수가 HaCaT 세포 배양에 미치는 영향 25
• 5. 성장인자(growth factor) 측정 결과 29
• IV. 고찰 33
• V. 결론 42
• 참고문헌 43
• ABSTRACT 49