Streptomyces sp. DB-54 균주의 항산화 활성 및 HepG2 세포증식 억제 효능 평가 = Evaluation of Antioxidant Activity and Anti-Proliferative Effect of Streptomyces sp. DB-54 on HepG2 Cells

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 토착 미생물 자원으로부터 항산화, 항암 활성을 갖는 균주를 선발하고 그 생리, 생화학적 및 분자생물학적 특성을 규명하여, 미생물 기반 항산화, 항암 기능성 소재 및 의약품 후보로서의 활용 가능성을 평가하였다. 곶자왈 토양은 pH 5.3–5.8의 약산성과 높은 전기전도도 2.5–4.0 dS/m, 유효 인산 119–156 mg/kg, 유기물 함량 45–69% 및 풍부한 치환성 양이온을 나타냈으며, DPPH 라디칼 소거능 측정에서 90–95%의 높은 소거 활성이 확인되었다. 곶자왈 토양의 eDNA를 추출하여 qPCR 분석을 통해 세균과 방선균 유전자량을 확인한 결과 1.26 × 10¹² copies/g, 1.71 × 10¹⁰ copies/g로 확인되었으며, 도말평판법에 의한 생균수는 세균 4.56 × 10⁷ CFU/g, 방선균 3.54 × 10⁶ CFU/g으로 확인되어 곶자왈 토양은 배양 및 비배양 미생물이 모두 풍부하게 존재하는 환경으로 확인되었다. 곶자왈 토양 eDNA의 16S rRNA 유전자 기반 메타지노믹스 분석 결과, Richness 1,109–1,311, Fisher’s alpha 196.95–230.66, Shannon 지수 4.52–5.06으로 높은 α-다양성이 확인되었으며, S1, D1 시료에서 34–35개 세균 문이 검출되었고 Pseudomonadota, Actinomycetota, Bacillota, Planctomycetota, Bacteroidota, Acidobacteriota, Verrucomicrobiota 등이 우점하여 산성 및 저영양 환경에 적응하고 유기물 분해와 질소, 탄소, 인 순환의 역할을 하는 다양한 미생물이 곶자왈 토양에 분포하는 것으로 판단되었다. 곶자왈 토양에서 분리한 167 균주 중 DPPH와 ABTS 분석을 통해 항산화 활성 균주 41 균주를 선발하였다. 특히 DB-54 균주는 DPPH 70%, ABTS 80%의 라디칼 소거능을 나타내어 수용성, 지용성 조건 모두에서 우수한 항산화 활성을 보이는 균주로 확인되었다. 항산화 활성 균주가 간암 세포주의 성장 및 생존에 미치는 영향을 평가하기 위해 HepG2에 24시간 처리한 뒤 CCK-8 assay로 세포 생존율을 평가한 결과, DB-6 균주는 10% 그리고 DB-54 균주는 5%의 세포 생존율 감소를 유도하는 것으로 확인되어 항암활성후보균주로선발되었다. 항암 활성이 확인된 DB-6와 DB-54에 대해 HepG2 이종이식 마우스 모델을 이용하여 in vivo 종양 성장 억제 효과를 평가하였다. HepG2 이종이식마우스 모델에서 DB-6와 DB-54를 15 mg/kg으로 42일간 종양에 직접 투여한 결과, 종양 부피는PBS 대조군에서0일대비42일차에1,392%증가하였고, DB-6 처리군에서는 1,122 %까지증가하였다. DB-54 처리군에서는 14일이후종양성장속도가감소하여 21 –35일차에 200–220% 범위에서 유지되었고, 42일차에는 172.8% 수준을 보였다. 특히, DB-54 처리군은 대조구 대비 88%의 종양성장 억제율을 나타내어 항산화 활성 및 항암 활성 우수 균주로 DB-54를 선발하였다. 선발된 DB-54의 16S rRNA 유전자 계통분석 결과, Streptomyces sp.로 명명되었다. Streptomyces sp. DB-54 처리에 따른 HepG2의 생장유지능 확인 결과 10–40 mg/mL에서는 24시간에 세포 밀도 감소와 단층 부분 소실이 나타났고, 50–100 mg/mL에서는 6-12시간 이내에 부착 세포 대부분이 소실되고 세포 잔해와 무세포 영역이 광범위하게 관찰되어 농도, 시간 의존적인 강한 세포독성과 세포사멸이 확인되었다. 유효 농도와 IC₅₀ 값은 약 55–60 mg/mL 범위로 나타났다. Streptomyces sp. DB-54의 전장 유전체 분석 결과, 10,351,029 bp (10Mb) 크기의 2개의 chromosomal DNA 확인되었으며, 71.8%의 높은 GC 함량을 확인하였다. 암호화 유전자는 9,215개가 존재하였으며 96개의 tRNA 와 21개의 rRNA가 존재하는 것으로 확인되었다. katA/katG, sodF/sodN, gpx1, trxA/B/C, ahpD/E/F 등 항산화, 산화스트레스 방어 유전자와 함께 산화적 인산화, TCA cycle, pentose-phosphate-pathway 관련유전자가집적되어있어에너지 대사와활성산소조절이연계된대사체계를보유한것으로확인되었다. HepG2에 대하여 Streptomyces sp. DB-54의 항암 기전은 p53의 의존적인 미토콘드리아 내재성 세포사멸 경로로 활성화 하는것으로 확인되었다. TP53 발현 증가와 함께 Bcl2 감소, Bax 증가, cytochrome c 방출 및 caspase-3 활성화가 유도되며, Western blot에서 p-p53 및 활성형 caspase 증가로 단백질 수준에서 확인되었다. 또한 Nrf2–Sod1 과 Tfrc–FTH1 발현을 조절하여 암세포의 항산화 방어와 철 유입, 저장 경로를 약화시키고 redox,철 항상성을 방해함으로써, p53 활성과 HepG2의 선택적세포사멸을유도하는것으로판단되었다. 이상, 곶자왈 토양은 이화학적 특성과 미생물 군집 구조 측면에서 항산화, 항암 활성 미생물 자원이 풍부한 저장고로 평가된다. Streptomyces sp. DB-54는 강한 항산화 활성과 in vitro, in vivo 항암 효과, 에너지, 항산화 대사가 연계된 유전체 구성, p53-의존적 세포사멸 및 redox, 철 대사 조절 기전을 동시에 보유한 핵심 균주로 확인되었으며, 향후 항암 의약품 및 항산화, 항암 기능성 소재 개발을 위한 핵심 기반 균주로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 5
• Ⅱ. 재료 및 방법 8
• 1. 제주 곶자왈 시료 채취 8
• 2. 비배양법을 이용한 곶자왈 토양 내 미생물 정량 분석 9
• 2.1. 곶자왈 토양 eDNA 추출 9
• 2.2. qPCR을 이용한 16S rRNA 유전자 정량 분석 9
• 3. 배양법을 이용한 곶자왈 토양 내 미생물 정량 분석 10
• 4. 16S rRNA 유전자 기반 Metagenomic 분석을 통한 토양 내 세균군집 다양성 분석 10
• 5. 곶자왈 토양으로부터 토착미생물의 순수 분리 11
• 6. 항산화 활성 우수 균주 분리 11
• 6.1. DPPH 라디칼 소거능 평가 11
• 6.2. ABTS 라디칼 소거능 평가 12
• 7. 무세포 배양상등액 제조 13
• 8. CCK-8 assay를 이용한 세포 성장 억제율 측정 13
• 9. Xenograft model 실험을 통한 종양 감소 효과 검증 14
• 10. 항산화 활성 및 항암 우수 균주 16S rRNA 유전자 계통분석 15
• 11. 미생물 배양액 농도처리에 따른 HepG2의 생장유지능 확인 16
• 12. 항암 활성 우수 균주의 전장 유전체 분석 16
• 12.1. Genomic DNA의 추출 16
• 12.2. Whole-genome sequencing 17
• 12.3. 항암 활성 관여 유전자 대사 네트워크 17
• 13. 항암 활성 유전자 발현량 정량 분석 18
• 13.1. qPCR 분석을 통한 철대사 관여 유전자 발현량 정량 분석 19
• 13.2. qPCR 분석을 통한 활성산소 조절 관여 유전자 발현량 정량 분석 19
• 13.3. qPCR 분석을 통한 세포사멸 관여 유전자 발현량 정량 분석 20
• 14. Western blotting을 이용한 항암 활성 단백질 발현 22
• Ⅲ. 결과 및 고찰 23
• 제 1 장 곶자왈 토양의 이화학적, 생물학적 특성 평가 23
• 1. 곶자왈 토양의 이화학적 특성평가 23
• 2. 비배양 기반 곶자왈 토양 내 세균 정량 분석 26
• 2.1. qPCR을 통한 세균 정량 분석 결과 27
• 2.2 배양법을 이용한 곶자왈 토양 내 세균 계수 29
• 3. 16S rRNA 유전자 기반 Metagenomic 분석을 통한 토양 내 세균 군집 다양성 분석 31
• 3.1 토양 세균 군집 구조 분석 34
• 3.2 산양 곶자왈 토양 내 주요 세균 군집 분석 35
• 3.3 동백동산 곶자왈 토양 내 주요 세균 군집 분석 38
• 제 2 장 곶자왈 토양 내 항산화 활성 균주 선발 42
• 1. 곶자왈 토양으로부터 토착미생물의 순수 분리 42
• 2. 항산화 활성 우수 균주 분리 43
• 2.1. DPPH 라디칼 소거능 평가 43
• 2.2. ABTS 라디칼 소거능 평가 44
• 제 3 장 HepG2에 대한 항암 활성 우수 균주 선발 47
• 1. CCK-8 assay를 이용한 세포 성장 억제율 측정 47
• 2. Xenograft model 실험을 통한 종양 감소 효과 검증 51
• 3. 항산화 활성 및 항암 우수 균주 16S rRNA 유전자 계통분석 57
• 제 4 장 항산화 및 항암 활성 우수 균주의 특성 평가 59
• 1. CCK-8 assay를 이용한 세포 성장 억제율 측정 59
• 2. 미생물 배양액 농도처리에 따른 HepG2의 생장유지능 확인 60
• 3. 항산화 활성 및 항암 활성 우수 균주의 전장 유전체 분석 63
• 3.1 Streptomyces sp. DB-54 균주의 genome 분석 63
• 3.2 Streptomyces sp. DB-54의 항산화, 산화스트레스 방어 유전자 특성 65
• 3.3 Streptomyces sp. DB-54의 산화적 인산화 대사 경로 분석 67
• 4. 항암 활성 유전자 발현량 정량 분석 71
• 4.1. 세포사멸 관여 유전자 발현 정량 분석 71
• 4.2. 항산화 스트레스 조절 유전자 발현량 정량 분석 74
• 4.3. 철 대사관여유전자발현정량분석 76
• 5. Western blotting을 이용한 항암 활성 단백질 분석 79
• IV. 종합결론 83
• V. 참고문헌 87
• Abstract 101