고지방식이로 유도된 비만 생쥐 모델에서 저령차전자탕의 항비만효과 = Anti-obesity effect of Jeoreong chajeonja-tang in high-fat diet induced obesity mouse model

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective: This study investigated the effects of Jeoreongchajeonja-tang in a high-fat diet-induced obesity mouse model.

Methods: The study examined 6-week-old male mice (C57bl/6J). The mice went through a 2-week adaptation period before being divided into four groups: the normal(C57bl/6J-Nr), control (high-fat diet only; HFD-CTL), positive-control (high-fat diet with Garcinia cambogia), and experimental (high-fat diet with Jeoreongchajeonja-tang; HFD-JCT) groups. After 7 weeks, the body weight, food efficiency ratio, organ weight, and visceral fat weight of the mice were measured. Blood serum tests, mRNA, liver histopathology, and epididymis adipocytes were also examined.
Results: Compared with the Control(HFD-CTL) group, the Experimental(HFD-JCT) group given Jeoreongchajeonja-tang showed significant reductions in absolute body weight and food efficiency ratio. The serum alanine aminotransferase, total-cholesterol, triglyceride, low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol, insulin-like growth factor-1, and leptin levels were significantly lower in the experimental group than in the control group. The serum high-density lipoprotein (HDL)-cholesterol and adiponectin levels were significantly higher in the experimental group than in the control group. Compared with the control group, the experimental group showed significant reductions in absolute abdominal subcutaneous fat, epididymal adipose tissue, kidney adipose tissue, intestine adipose tissue, and liver, kidney and spleen adipose tissue weights. The C/EBP-β, leptin, and SREBP1c/ADD1 mRNA expression were significantly lower in the experimental group than in the control group, while the UCP-2 and adiponectin mRNA expression were significantly higher. Compared with the control group, the experimental group showed a significant reduction in the absolute adipocyte area in the liver and epididymal adipose tissue.

Conclusion: Jeoreongchajeonja-tang has an anti-obesity effect. Additional clinical studies are expected.

국문 초록 (Abstract)

비만은 체내 지방의 과잉 축적 상태로, 인종과 나라에 따라 기준이 다르지만 현재 한국인의 비만 진단 기준은 체질량 지수로는 25kg/m2이상, 허리둘레로는 남자에서는 90cm 이상, 여자에서는 85cm 이상으로 정의한다. 비만은 대사증후군, 죽상동맥경화증, 심혈관계질환, 당뇨, 암 등 심각한 합병증을 발생시키기에 의학계에서 비만 및 대사증후군을 조기에 진단하고 치료하는 것은 관심 사안이며. 체중을 감량하여 합병증을 예방하는 것이 비만 치료의 일차적인 목표가 된다. 비만의 치료는 현재 현대의학에서는 Therapeutic life style change로 일컬어지는 행동치료, 식사치료, 운동치료가 주가 되고 있으며 보조적으로 약물치료가 사용되고 있고 적응증에 따라 고도비만의 경우 수술치료 등을 고려해볼 수 있다. 하지만 현대의학에서 비만의 약물 치료는 까다로운 적응증을 만족하는 경우에만 사용하는 보조요법에 불과하며 입마름, 변비, 선천태아기형, 복부팽만, 설사, 지방변 등 다양한 부작용이 있어 비만 치료에 있어 다양한 한의학 및 대체의학 요법에 대한 수요가 급증하고 있다.
豬苓車前子湯은 東醫壽世保元 제 9장 少陽人 脾受寒表寒病論에 나오는 처방이며 少陽人 亡陰證 身熱頭痛泄瀉, 腹痛을 治療하는 處方이다. 임상에서는 少陽人의 비만, 대사증후군, 소화기질환, 치매 등 폭넓은 질환에 사용되고 있다. 그러나 아직까지 豬苓車前子湯의 항비만 효과에 대해 규명한 연구는 많지 않은 실정이다. 따라서, 豬苓車前子湯의 항비만 효과를 알아보기 위해 C57bl/6J 마우스를 고지방 식이로 비만을 유발시켜, 실험을 진행하였다. C57bl/6J 마우스에 2주간 기본사료(AIN-76A diet)를 적응시킨 후 9주령부터 Diet Induced Obesity Diet Formulas (D12492) 60 kcal% fat 식이를 섭취시켜 평균체중이 28g~29g사이에 도달하면 저령차전자탕 추출물을 투여하였다. 실험군으로는 정상식이를 투여한 Normal군(이하 정상군(C57bl/6J-Nr)), 고지방식이 (High fat diet; HFD)를 투여한 control군(이하 대조군(HFD-CTL)), HFD에 저령차전자탕 300mg/kg를 투여한 실험군(이하 HFD-JCT), HFD에 garcinia cambogia 245mg/kg를 투여한 양성대조군(이하 HFD-GK)으로 나누었으며, 각 그룹당 6마리씩으로 7주 동안 하였다. 이후, 체중증가량 및 식이효율을 측정하였고, 혈청 생화학적 검사를 통해 Creatinine과 AST (Aspartate Transaminase), ALT (Alanine Transaminase)로 신장 독성, 간 독성 검사를 시행하였고, 총콜레스테롤 (Total Cholesterol), 중성지방 (Triglyceride), HDL (High-density lipoprotein) cholesterol, LDL (Low-density lipoprotein) cholesterol 의 지질 검사를 시행하여 고지혈증에 대한 효과를 평가하였다. 또한, ELISA를 사용하여 혈청 내 단백질 호르몬인 Leptin, IGF-1 (Insulin Growth Factor-1), Adiponectin을 분석하였고, 또한 복부 피하지방, 부고환주변 지방조직, 신장주변 지방조직, 창자주변 지방조직의 중량 변화를 측정하였다. 간과 부고환 지방조직에서 Real-time PCR을 사용하여 비만 관련 유전자의 전사(AP2/FABP4 mRNA, C/EBP-β mRNA UCP-2 mRNA Adiponectin mRNA Leptin mRNA SREBP1c/ADD1 mRNA)를 분석하였고 마지막으로 간과 부고환 지방세포를 병리조직학적으로 분석하여 간에서는 H&E 염색과 Oil Red O염색으로 지방세포를 관찰하였고, 부고환에서는 지방세포의 크기를 비교하였다.
그 결과 실험군(300mg/kg 저령차전자탕 추출물 투여군)은 대조군에 비해 체중 증가가 억제 되었고, 식이 효율이 유의하게 감소하였다. 혈청 생화학적 검사에서는 300mg/kg 저령차전자탕군이 대조군에 비해 ALT, 총콜레스테롤, 중성지방, LDL-cholesterol 농도가 유의하게 감소한 반면, Glucose와 HDL-cholesterol 농도는 유의하게 증가하였다.
혈중 단백질 호르몬 검사에서는 실험군(300mg/kg 저령차전자탕 추출물 투여군)에서 대조군에 비해 Leptin, IGF-1 농도는 유의하게 감소하였고, Adiponectin은 유의하게 증가하였다.
실험군(300mg/kg 저령차전자탕 추출물 투여군)은 복부 피하지방, 부고환주변 지방조직, 신장주변 지방조직, 창자주변 지방조직의 중량이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
간과 부고환 지방 조직에서 유전자 발현 검사를 통해 실험군(300mg/kg 저령차전자탕 추출물 투여군)에서 대조군에 비해 C/EBP-β mRNA, Leptin mRNA, SREBP1c/ADD1 mRNA가 유의하게 감소하였고, UCP-2 mRNA, Leptin mRNA는 유의하게 증가시켰다.
간과 부고환 지방 조직을 병리조직학적으로 분석한 결과, 실험군(300mg/kg 저령차전자탕 추출물 투여군)에서 대조군에 비해 간 조직의 회식지방축적세포와 거대소포성(macrovesicular) 지방세포가 눈에 띄게 줄어들었고, 부고환 지방조직에서 Adipocyte 크기 증가가 억제되었다.
이상의 결과를 통해 저령차전자탕이 고지방사료로 비만을 유도한 마우스 모델에서 항비만 효과가 있음을 알 수 있었으며, 향후 작용 매카니즘의 규명 및 다른 약물과의 병행 투여 등을 통해 상호작용, 효과성, 독성 등에 연구가 필요할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 목 차 ⅰ
• 표 목 차 ⅱ
• 그림목차 ⅲ
• 논문요약 ⅳ
• Ⅰ. 서 론 10
• Ⅱ. 연구재료 및 연구방법 13
• 1. 실험재료 및 준비 13
• 1) 시약 및 실험기기 13
• 2) 생약 및 생약 추출물 분리 14
• 2. 연구 방법 15
• 1) 비만 유발 동물모델 및 실험설계 15
• 2) 체중, 식이섭취량 및 식이효율의 측정 17
• (1) 체중(body weight) 17
• ① 체중변화 17
• ② 총 체중 증가량 17
• ③ 1일 평균 체중 증가량 17
• (2) 식이섭취량(food intake) 17
• ① 1일 평균 식이 섭취량 17
• (3) 식이효율 (food efficiency ratio, FER) 17
• ① FER 17
• 3) 혈청 생화학적 검사 18
• 4) 혈청 Leptin, IGF-1, adioponectin 분석 19
• 5) 장기 및 부위별 지방 중량 측정 20
• 6) 간, 부고환 지방세포 유전자 발현 분석 21
• 7) 병리조직학적 분석 24
• 3. 통계 처리 25
• Ⅲ. 연구결과 26
• 1. 체중변화에 미치는 영향 26
• 2. 체중증가량 및 식이효율에 미치는 영향 28
• 3. 혈청 생화학적 변화에 미치는 영향 31
• 1) 독성 검사 31
• (1) 신장독성(creatinine) 에 미치는 영향 31
• (2) 간독성(AST, ALT) 에 미치는 영향 33
• 2) 혈청 포도당(glucose)량에 미치는 영향 35
• 3) 혈청 유리지방산(Free fatty acid)량에 미치는 영향 37
• 4) 혈중 지질학적 변화에 미치는 영향 39
• (1) 혈중 총콜레스테롤(T-Cholesterol)량에 미치는 영향 39
• (2) 혈중 중성지방(Triglyceride)량에 미치는 영향 41
• (3) 혈중 고밀도 지방단백, 저밀도 지방단백 콜레스테롤(HDL-cholesterol, LDL-cholesterol)량에 미치는 영향 43
• 4. 혈중 호르몬 단백질량 변화에 미치는 영향 46
• 1) 혈중 IGF-1 단백질량에 미치는 영향 46
• 2) 혈중 Leptin 단백질량에 미치는 영향 48
• 3) 혈중 Adioponectin 단백질량에 미치는 영향 50
• 5. 장기 및 부위별 지방 중량 변화에 미치는 영향 52
• 1) 복부 피하지방, 부고환, 신장, 창자주변 중량변화에 미치는 영향 52
• 2) 간, 신장, 비장 중량변화에 미치는 영향 54
• 6. 비만관련 유전자 발현에 미치는 영향 56
• 1) AP2/FABP4 mRNA 유전자 발현 분석 56
• 2) C/EBP-β mRNA 유전자 발현 분석 58
• 3) UCP-2 mRNA 유전자 발현 분석 60
• 4) Adiponectin mRNA 유전자 발현 분석 62
• 5) Leptin mRNA 유전자 발현 분석 64
• 6) SREBP1c/ADD1 mRNA 유전자 발현 분석 66
• 7. 병리조직학적 분석 68
• 1) 간의 병리조직학적 분석 68
• 2) 부고환 지방 세포의 병리조직학적 분석 70
• 3) 지방세포 크기 변화에 미치는 영향 72
• Ⅳ. 고 찰 74
• Ⅴ. 결 론 84
• 참 고 문 헌 86
• 영 문 초 록 94