Crystal structure of an antibody specifically recognizing lorazepam

국문 초록 (Abstract)

로라제팜은 불안과 긴장을 완화하기 위해 사용되는 벤조디아제핀 계열의 향정신성 약물로, 의존성과 오·남용의 위험이 존재한다. 본 연구에서는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 로라제팜을 특이적으로 인지하는 항체 L1A3와 L1B1을 scFv 형태로 발굴하였다. 그러나 항체의 결정화를 다양한 조건에서 시도했음에도, 초기에는 결정 형성이 관찰되지 않았다. 결정화 능력을 향상시키기 위해 scFv를 Fab 형태로 전환한 뒤 두 가지 변이를 도입하였다. 첫 번째는 가변 영역의 엘보(elbow) 영역을 안정화하는 것으로 알려진 EL2 변이이며, 두 번째는 경쇄의 불변 영역의 유연성을 감소시키는 “crystal kappa” 변이이다. 두 변이를 결합한 L1B1 EC 변이는 성공적으로 결정화되었으며, apo 상태에서 2.3 Å 해상도의 결정 구조를 확보할 수 있었다. 또한 DiffDock을 활용하여 L1B1과 로라제팜 사이의 결합 인터페이스를 예측하였고, 주요 상호작용 잔기에 대한 돌연변이 분석을 통해 이들이 로라제팜 인식에 필수적임을 검증하였다. 더불어 다른 벤조디아제핀 계열 약물과의 구조적 비교를 통해 L1B1 EC의 선택성이 발현되는 구조적 기전을 규명하였다. 종합적으로 본 연구는 항체 L1B1이 lorazepam을 선택적으로 인식하는 구조적 기반을 제시하며, 향후 고특이성 항체 기반 진단 및 치료제 개발에 유용한 통찰을 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Lorazepam is a benzodiazepine psychoactive drug used to relieve anxiety and tension; however, it carries potential risks of dependence and abuse. In this study, we isolated two antibodies, L1B1 and L1A3, that specifically recognize lorazepam from synthetic human scFv libraries using phage display. Initial crystallization trials of the wild-type antibodies were unsuccessful, yielding only clear drops under various conditions. To facilitate crystallization, we engineered the Fab format by introducing two mutations: the EL2 mutation, known to stabilize the elbow region of the variable domain, and the "crystal kappa" mutation, which reduces flexibility in the constant region of the light chain. This dual-mutant strategy enabled the crystallization of the engineered variant, L1B1 EC. The crystal structure of L1B1 EC in the apo state was determined at a resolution of 2.3 Å. The binding interface between L1B1 and lorazepam was predicted using DiffDock, and biochemical analyses of key residues confirmed their critical roles in ligand recognition. Furthermore, structural comparisons with other benzodiazepines provided insights into the selectivity of L1B1 EC. Overall, this study establishes the structural basis for the selective recognition of lorazepam by L1B1, offering valuable insights for developing highly specific antibodies for diagnostic or therapeutic applications.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. INTRODUCTION 1
• Chapter 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 2.1. Bio-panning of scFv clones specific to lorazepam 4
• 2.2. Reformatting from scFv to Fab 5
• 2.3. Expression and purification of antibody 5
• 2.4. Dynamic light scattering (DLS) 7
• 2.5. Characterization of scFv clones by ELISA 7
• 2.6. Crystallization, X-ray crystallography, phasing and refinement 8
• Chapter 3. RESULTS 10
• 3.1. Bio-panning of scFv clones specific to lorazepam 10
• 3.2. Affinity determination and cross-reactivity of L1A3 and L1B1 15
• 3.3. Fab engineering, expression, and purification of L1A3 and L1B1 for crystallographic analysis 19
• 3.4. Protein engineering to enhance antibody rigidity for crystallization 25
• 3.5. Crystallization and X-ray diffraction analysis of the L1B1 EC Fab 27
• 3.6. Computational prediction of the lorazepam binding site 35
• 3.7. Validation of the L1B1 EC Epitope 37
• 3.8. Structural Compatibility of Benzodiazepine Analogs 39
• Chapter 4. DISCUSSION 41
• REFERENCES 49
• 논문요약 53