The Doppel protein: a regulator of angiogenesis and an emerging therapeutic target for antibody-drug conjugate therapy = 도펠 단백질: 혈관신생의 조절자이자 항체-약물 접합체(ADC) 치료의 새로운 표적

국문 초록 (Abstract)

항체–약물 접합체(ADC)는 종양 선택적 항체와 강력한 세포독성 페이로드를 결합한 표적 치료 플랫폼으로 주목받아 왔다. 그러나 고형암에서의 ADC 치료는 여전히 세 가지 근본적인 한계에 직면해 있다. 이는 용량 제한 독성, 치밀한 종양 기질로 인한 낮은 종양 내 침투, 그리고 종양 이질성과 항원 소실에 따른 치료 내성이다.

본 학위논문에서는 이러한 한계를 극복하도록 설계된 도펠(Doppel) 단백질 표적 ADC의 합리적 설계와 개발을 제시한다. 본 연구는 표적 단백질 도펠의 기능적 규명, 종양 혈관을 표적으로 하는 방관자 사멸 효과 기반 항-도펠 ADC의 공학적 설계, 그리고 해당 ADC 치료에 최적의 적응증이 되는 희귀 암의 선정까지 아우르며, 이를 통해 ADC 개발의 핵심 생물학적·공학적 요소들을 통합적으로 다룬다.

제1장에서는 표적 암 치료의 광범위한 맥락에서 기존 ADC 플랫폼을 개괄하고, 주요 성과와 남아 있는 한계를 비판적으로 검토한다. 이어서 항-도펠 ADC의 구성 요소—표적 단백질 도펠, 항체, 그리고 사용된 링커—에 대한 기존 문헌을 종합적으로 정리한다. 이를 바탕으로 항-도펠 ADC 개발을 뒷받침하는 과학적 근거와 연구 필요성을 명확히 제시한다.

제2장에서는 종양 혈관신생에서의 도펠의 생물학적 기능을 규명한다. In-Silico 분석과 실험적 접근을 결합하여 도펠이 혈관신생 Tip 세포 (Tip cell)에 선택적으로 발현되며, 이들의 기능을 촉진함을 보여준다. 또한 항-도펠 항체를 통한 도펠 억제가 종양 혈관을 감소시키고 종양 퇴행을 유도함을 입증한다. 특히 도펠 억제 기전은 VEGFR2나 DLL4와 같은 기존 Tip 세포 표적과는 구별되며, 유사한 항종양 효과를 유지하면서도 더 높은 표적 특이성을 달성한다. 종합적으로, 본 연구는 종양 혈관 전체를 광범위하게 억제하기보다는 혈관신생을 주도하는 특수화된 내피세포 하위집단을 정밀하게 표적화하는 전략의 중요성을 강조한다.

제3장에서는 내피세포 표적화와 카스파제 절단형 링커를 결합한 항-도펠 ADC의 설계 및 개발을 다룬다. 해당 ADC는 도펠이 Tip 내피세포에 발현된다는 점에 착안하여, 종양 내피세포에 선택적으로 결합함으로써 비표적 독성을 감소시키고, 온전한 ADC가 종양 기질 깊숙이 침투해야 할 필요성을 줄이도록 설계되었다. 기존의 ValCit 링커와 비교할 때, caspase-절단형 KGDEVD 링커는 향상된 방관자 사멸 효과를 유도하고 종양 조직 내 페이로드 확산을 촉진한다. 또한 반복 투여 시 in-situ 증폭 기전을 통해 세포독성을 강화하여 종양 이질성과 치료 내성을 완화한다. 종합적으로, 본 연구는 종양 세포를 직접 표적화하는 대신 종양 내피세포를 표적화하는 새로운 ADC 치료 패러다임을 제시한다.

마지막으로 제4장에서는 항-도펠 ADC 플랫폼의 치료적 잠재력을 혈관 기원 악성종양인 혈관육종(angiosarcoma)에서 입증한다. 혈관육종은 높은 전이율, 낮은 생존율, 그리고 비정상적인 혈관 증식을 특징으로 하는 공격적인 암이다. 종양 세포 자체가 내피세포 기원을 갖는다는 점에서 도펠 발현이 높을 뿐 아니라, 혈관육종의 고도로 혈관화되고 구조적으로 다공성인 특성이 거대분자 약물 전달의 장벽을 낮춰 항-도펠 ADC 치료에 특히 적합하다. 이에 따라 항-도펠 ADC는 혈관육종 종양 조직에 효과적으로 침투하였으며, KU-CAS3 이종이식 모델 및 혈관육종 환자 유래 이종이식(PDX) 모델에서 강력한 항종양 효과를 보였다.

본 연구는 표적(Doppel), 표적화 항체, 링커–페이로드 시스템, 그리고 질환 적응증(혈관육종)이라는 네 가지 핵심 요소의 유기적 통합이 성공적인 표적 치료의 핵심임을 보여준다. 이는 독성, 조직 침투 부족, 그리고 내성이라는 기존 ADC의 한계를 극복할 수 있는 차세대 합리적 설계 ADC 개발을 위한 새로운 프레임워크를 제시한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Antibody–drug conjugates (ADCs) have emerged as a powerful class of targeted cancer therapeutics by coupling tumor-selective antibodies to highly potent cytotoxic payloads. Yet, despite remarkable clinical successes, ADC efficacy in solid tumors remains constrained by three persistent limitations: residual dose-limiting toxicity, poor intratumoral penetration due to dense stromal barriers, and the development of resistance driven by tumor heterogeneity and antigen loss.

This dissertation presents the rational design and development of a Doppel protein targeting ADC engineered to address these longstanding limitations. This work integrates three key components of ADC development: functional characterization of the target protein Doppel, engineering of a tumor vasculature–targeted, bystander-killing anti-Doppel ADC, and selection of a rare cancer that represents an optimal therapeutic indication for this approach.

Chapter 1 provides an overview of existing ADC platforms within the broader landscape of targeted cancer therapy, highlighting both past successes and current challenges. This is followed by a synopsis of the current literature on the components of the anti-Doppel ADC; including studies on the target protein Doppel, as well as prior work relevant to the antibody and linker employed in this study. On this basis, the rationale necessitating the development of the anti-Doppel ADC is articulated.

Chapter 2 establishes Doppel as a tumor-associated endothelial protein preferentially expressed in angiogenic tip cells, where it supports tip cell function, using a combination of computational and experimental approaches. Furthermore, this study demonstrates that antibody-mediated inhibition of Doppel reduces tumor vasculature and induces tumor regression. Notably, the mechanism of Doppel inhibition is distinct from that of conventional tip-cell targets such as VEGFR2 and DLL4, achieving greater target specificity while maintaining comparable therapeutic efficacy. Together, this study highlights the importance of selectively targeting specialized endothelial subpopulations that drive angiogenesis, rather than broadly inhibiting the entire tumor vasculature.

Chapter 3 builds on this biology and describes the development of an anti-Doppel ADC in which endothelial targeting is combined with a caspase-cleavable linker to enhance tissue penetration and mitigate resistance mechanisms. This design enables selective binding to tumor endothelium, reducing off-target effects and circumvents the need for deep stromal penetration of the intact ADC. Compared with a conventional ValCit linker, the KGDEVD linker enables enhanced bystander killing and deeper payload diffusion into tumor tissue. Moreover, repeated dosing of the anti-Doppel ADC promotes in-situ amplification of cytotoxic activity, thereby overcoming tumor heterogeneity and resistance. Collectively, this study proposes an alternative paradigm for ADC therapy: rather than directly targeting tumor cells, the anti-Doppel ADC targets the tumor endothelium, where localized payload release allows more efficient penetration into the tumor stroma and broader antitumor activity.

Finally, in Chapter 4, the full therapeutic potential of this platform is demonstrated in angiosarcoma; an aggressive endothelial malignancy characterized by high metastatic potential, poor survival, and aberrant vascular proliferation. In addition to elevated Doppel expression in the malignant cells themselves—reflecting their endothelial lineage—angiosarcoma’s highly vascular and structurally porous architecture reduces stromal barriers to macromolecular drug delivery, rendering this disease particularly well suited to anti-Doppel ADC therapy. Consistent with this, the Doppel-targeting ADC efficiently penetrates angiosarcoma tumors, resulting in robust antitumor efficacy in cell and patient-derived angiosarcoma xenograft models.

Collectively, these findings underscore the importance of synergistic design in targeted therapy—where success depends not on a single component, but on the integration of four critical elements: the target (Doppel), the targeting moiety (antibody), the cytotoxic payload (linker–drug system), and the disease indication (angiosarcoma). Together, these define a framework for the next generation of rationally engineered ADCs capable of overcoming the long-standing barriers of toxicity, tissue penetration, and resistance in cancer therapy.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iii
• List of Figures vi
• Abbreviations xxiii
• Chapter 1. Introduction
• 1.1 Current landscape of ADC
• 1.1.1 Design of antibody drug conjugates １
• 1.1.2 The first generation of ADCs and dose-limiting toxicities ５
• 1.1.3 Transition from hematologic to solid tumors ７
• 1.1.4 Tumor penetration and the bystander killing effect ８
• 1.1.5 The bystander effect and overcoming tumor heterogeneity １０
• 1.1.6 Need for novel targets for ADC development. １０
• 1.2 The Doppel protein
• 1.2.1 The Doppel protein in brain function and spermatogenesis １２
• 1.2.2 The Doppel protein in the context of cancer １２
• 1.2.3 The Doppel protein in the context of angiogenesis １３
• 1.3 The anti-Doppel antibody １４
• 1.4 The DEVD peptide １６
• 1.5 Research Rationale １９
• 1.6 Reference ２２
• Chapter 2. Doppel as a tip endothelial cell specific target for as a therapeutic targeting of tumor angiogenesis
• 2.1 Introduction ３０
• 2.2 Materials and Method ３２
• 2.3 Results
• 2.3.1 Doppel expression in tip cells ３６
• 2.3.2 Doppel in endothelial cells contributes to tumor growth ３９
• 2.3.3 Doppel function in Tip cells: VEGFR2 signaling ４２
• 2.3.4 Doppel function in Tip cells: Cytoskeleton Rearrangement ４４
• 2.3.5 anti-Doppel Ab reduces angiogenesis and delays tumor growth . ４７
• 2.4 Discussion ５１
• 2.5 Conclusion ５５
• 2.6 References ５６
• Chapter 3. anti-Doppel Antibody Drug Conjugates
• 3.1 Introduction ６０
• 3.2 Materials and Method ６２
• 3.3 Results
• 3.3.1 Doppel induction by the tumor microenvironment ７０
• 3.3.2 Doppel induction by exosomes of the tumor microenvironment ７０
• 3.3.3 Doppel expression in tumor endothelial cells ７６
• 3.3.4 Doppel expression in clinical tissue ７９
• 3.3.5 Binding of 3H9Cy5.5 to tumor endothelial cells and biodistribution ８２
• 3.3.6 Synthesis and characterization of 3H9-KGDEVD-MMAE ８５
• 3.3.7 Binding of 3H9-KGDEVD-MMAE to the tumor endothelium ８７
• 3.3.8 TEC specific cytotoxicity of 3H9-KGDEVD-MMAE ８９
• 3.3.9 Vascular Disruption induced by 3H9-KGDEVD-MMAE ９１
• 3.3.10 Caspase-mediated linker activation ９４
• 3.3.11 Tissue penetration ９７
• 3.3.12 Overcoming resistance: efficacy with repeated dosing １０２
• 3.3.13 Efficacy in multiple tumor types １０４
• 3.3.14 Pharmacokinetics of 3H9-KGDEVD-MMAE １０６
• 3.3.15 Toxicity of 3H9-KGDEVD-MMAE １０８
• 3.4 Discussion １１１
• 3.5 Conclusion １１５
• 3.6 Reference １１７
• Chapter 4. Treatment of angiosarcoma with anti-Doppel Antibody Drug Conjugates
• 4.1 Introduction １２０
• 4.2 Materials and Method １２２
• 4.3 Results
• 4.3.1 Doppel expression in clinical samples of Angiosarcoma １２６
• 4.3.2 anti-Doppel ADC mechanism of action in angiosarcoma １２８
• 4.3.3 Distribution of 3H9 in tumor tissue １３０
• 4.3.4 Efficacy of 3H9-KGDEVD-MMAE in CDX models １３４
• 4.3.5 Efficacy of 3H9-KGDEVD-MMAE in PDX models １３７
• 4.4 Discussion １３９
• 4.5 Reference １４２
• Chapter 5. Concluding Remarks １４５