생물테러 독소 항원 시험용 capture ELISA 키트 개발 = Development of the experimental capture ELISA kit for bioterrorism toxin antigen

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Botulinum toxin A, Botulinum toxin B and ricin are wel-known to be cautious biochemical reagents, severe toxic without a special medicine. Centers for disease control & prevention has ben developing rapid screning kits for detection of thre toxins and distributing them to the bioterism response system since 206. There is necesary to improve the abili ty o f de tec tion for more speci fic and rapid confirmation experiments against each thre toxins on the isue. Botulinum toxin A and B consist of heavy chain(Translocation domain, receptor binding domain) and light chain(catalytic domain) by linking with disulfide bond betwen translocation domain and catalytic domain. Ricin(60~65kDa) consists of A-chain(267 a.a) and B-chain(262 a.a) by linking with disulfide bond. Our goal is to develop the thre capture ELISA kits to measure concentrations in special sample. Four predicted peptide antigens and four recombinant proteins(RBD ful, RBD smal, translocation domain, catalytic domain) are used to develop polyclonal antibodies and monoclonal antibodies for botulinum toxin A, B capture ELISA kit. Thre predicted peptide antigens, two recombinant proteins(A-chain, B-chain) and native protein(from Ricinus communis) are used to develop polyclonal and monoclonal antibodies for ricin capture ELISA kit. In conclusion, pair test, optimzation, validation are conducted by using as the capture antibodies and detector antibodies. The detection range of botulinum toxin A and B ELISA is 1.56 ~ 10 ng/mL, That of ricin is 78 ~ 500 pg/mL. LLD (lowest limit of detection) is 0.601 ng/ml(toxin A), 0.071 ng/ml(toxin B), 5.67 pg/ml(Ricin) by the sensitivity test and precision test (inter asay, intra asay) are in les 20% (CV, the percentage coeficient of variation), respectively.

국문 초록 (Abstract)

보툴리눔 독소와 Ricin 독소는 독성이 강하고, 치료제가 없으며 습득이 상대적으로 용이하여 유의해야할 주요 생물학 작용제로 알려져 있다. 질병관리본부에서는 2006년부터 신속 스크리닝 키트를 개발하여 일선 생물테러 대응 기관 (생물테러대응 등급A 실험실)에 배포하여 활용하고 있다. 이를 보강하기 위한 선별된 단백 독소 작용제의 신속한 확인 시험을 위한 진단 능력을 강화할 필요성이 제기되었다. 생물테러에 대비하여 독소 확인시험용 capture ELISA 키트를 개발하여 현장 대응에 활용하고, 실험실네트워크(Laboratory Response Network) 운영 강화에 활용하고자 한다. 보툴리눔 독소 A와 B는 크게 Heavy chain(Translocation domain, receptor binding domain)과 light chain(catalytic domain)으로 구성되어 있고 translocation domain과 catalytic domain이 disulfide bond로 결합되어 있다. Ricin(60~65kDa)은 A-chain(267 a.a)과 B-chain(262 a.a)으로 구성되어 있으며 disulfide bond에 의해 결합되어 있다. 영인프런티어에서는 보툴리눔 독소 A와 독소 B는 각각 항원성이 높고 구조를 인식할 수 있는 항체 생산을 위해 예측한 펩타이드 항원 4개, 재조합 단백질 4개(receptor binding domain full, receptor binding domain small, translocation domain, catalytic domain)를, Ricin은 예측한 펩타이트 3개, 재조합 단백질 2개(A chain, B chain), 천연 단백질 1개(피마자씨에서 추출)를 이용하여 단클론 항체와 다클론 항체를 개발하여 샘플내의 보툴리눔 독소 A, 보툴리눔 독소 B, Ricin의 양을 측정할 수 있는 capture ELISA kit 3종을 개발을 목표로 하였다. 결론적으로, 개발된 항체를 사용하여 pair test, optimization와 validation을 수행하였고 보툴리눔 독소 A ELISA kit은 1.56 ~ 100 ng/mL, 보툴리눔 독소 B ELISA kit은 1.56 ~ 100ng/mL, Ricin ELISA kit 은 78 ~ 5000 pg/mL의 detection range를 보였으며, 각 LLD(limit of lowest detection)는 0.601 ng/ml, 0.071 ng/ml, 5.67 pg/ml이었다. 정확도 (inter assay, intra assay)를 나타내는 CV(%, coefficient of variation)는 모두 20%이하를 유지하였다.