단백질체 분석을 통한 Xanthomonas spp. 유전자의 기능 분석 연구 = Functional Analysis of wxcB and omp1X Genes in Xanthomonas spp. Using a Proteomics Approach

국문 초록 (Abstract)

단백질체 분석은 단백질의 기능을 상정하고 규명하는 유용한 기술이다. 본 논문의 첫 번째 연구에서는 shotgun proteomic analysis를 통해, 벼흰잎마름병을 일으키는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)의 PXO_03968 유전자(이전에 ax21이라 알려진)의 기능을 식별하였다. PXO_03968 유전자에 의해 코딩되는 단백질 서열의 예상 구조는 N-terminus에 signal peptide와 10개의 β–strand를 가진 β–barrel domain을 가지고 있어 porin과 같은 단백질로 추정되었다. 그러므로 PXO_03968 유전자를 omp1X(outer membrane protein1 in Xoo)라고 재명명하고 omp1X knock out 돌연변이(Xoo△omp1X)를 만들어 야생형과 돌연변이에서의 단백질 발현 수준을 비교하였다. 그 결과, 야생형과 돌연변이 균주 사이에서 106개의 단백질에 1.5배 이상의 큰 발현 차이를 보였다. 또한, Clusters of Orthologous Groups(COGs) 분석을 통해 이러한 단백질들이 운동성과 신호전달에 특히 관여하는 것으로 나타났다. COGs 분석 결과에 따라 표현형 assay를 진행하자 돌연변이 균주에서 운동성과 생물막 형성이 야생형 균주에서 보다 낮은 것으로 확인 되었다. 이러한 결과는 그람 음성균의 외막 단백질의 기능에 대한 새로운 이해를 가져왔다고 판단된다.
박테리아의 외피는 외부의 환경 스트레스에 대한 보호와 기주 식물을 감염 시키기 위한 병원성 같은 다양한 기능을 지니고 있다. 본 논문의 두 번째 연구에서는 토마토와 피망에서 세균성 반점병을 유발하는 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria의 wxcB 유전자의 기능을 규명하는 실험을 진행하였다. wxcB의 기능을 특징짓기 위해, wxcB knock out 돌연변이(Xcv△wxcB)를 만들고 토마토에 접종하여 병원성이 야생형 균주보다 약한 것을 확인하였다. 또한, 야생형과 돌연변이의 단백질 발현을 비교하여 wxcB에 의해 영향을 받을 mechanism을 예측하였다. 152개의 단백질이 야생형과 돌연변이에서 2배 이상의 큰 발현 차이를 보였다. 이러한 단백질들 중에는 운동성과 세포벽 및 세포막에 관련한 단백질들이 가장 많은 비중을 차지하였다. 표현형 assay를 통해 돌연변이 균주가 야생형 균주에 비해 운동성과 SDS 저항성은 감소하고 생물막 형성은 증가된 것으로 확인 되었다. 흥미로운 결과는 LPS가 야생형과의 차이를 보이지 않았다는 것이다. 이러한 결과는 병원균의 병원성에 많은 영향을 미치는 세포벽 및 세포막의 기능과 연관된 wxcB의 역할에 대한 새로운 이해와 더 많은 연구로 이어지게 할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Proteomic analysis is a useful technique for postulating and elucidating protein functions. In the present work, a shotgun proteomic analysis was used to identify functions of the PXO_03968 gene (previously known as the ax21) from Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), a causal agent for bacterial blight disease in rice. Structural prediction performed on the protein sequence encoded by PXO_03968 reveals that it encodes a putative porin-like protein, possessing a β-barrel domain with 10 β-strands and a signal peptide at the N-terminus. It was generated that the gene, renamed as an omp1X (outer membrane protein 1 in Xoo), knock out mutant (XooΔomp1X) and compared the protein expression level in the mutant to that in the wildtype. A total of 106 proteins displayed a greater than 1.5-fold difference in expression between the mutant and the wildtype strains. Clusters of Orthologous Groups analysis revealed that these proteins are involved in cell motility as well as signal transduction. In addition, phenotypic analysis demonstrated that motility and biofilm formation in XooΔomp1X are lower than the wildtype. These results provide new insights into the functions of outer membrane proteins in Gram-negative bacteria.
The bacterial envelope possesses diverse functions, including protection against environmental stress and virulence factors for host infection. Here, the function of wxcB in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is reported, a causal agent of bacterial leaf spot disease in tomato and pepper. To characterize roles of wxcB, a knockout mutant (XcvΔwxcB) is generated and it is found that the virulence of the mutant was weaker than that of the wild type in tomato plants. To predict the mechanism affected by wxcB, protein is compared expressions between the wild type and the mutant. Expression of 152 proteins showed a greater than 2-fold difference. Proteins involved in motility and cell wall/membrane were the most abundant. Through phenotypic assays, it is further demonstrated that the mutant displayed reduced motility and tolerance to treatment, but it showed increased biofilm formation. Interestingly, the LPS profile was unchanged. These results lead to new insights into the functions of wxcB that is associated with cell wall/membrane functions, which contributes to pathogen virulence.

목차 (Table of Contents)

• 1. Proteomic and functional analyses of a novel porin-like protein in Xanthomonas oryzae pv. oryzae 1
• 1.1 Introduction 1
• 1.2 Materials and Methods 4
• 1.2.1 Bacterial strains and growth conditions 4
• 1.2.2 In silico modeling 4
• 1.2.3 Construction of omp1X gene knockout and complemented strains 4
• 1.2.4 Protein extraction and Peptide preparation 6
• 1.2.5 Mass spectrometry analysis 7
• 1.2.6 Protein/Peptide identification and quantification 8
• 1.2.7 Motility assay 9
• 1.2.8 Biofilm assay 9
• 1.3 Results and Discussions 11
• 2 Functional and proteomic analyses reveal that wxcB is involved in virulence, motility, detergent tolerance, and biofilm formation in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 31
• 2.1 Introduction 31
• 2.2 Materials and Methods 34
• 2.2.1 Bacterial strains and growth conditions 34
• 2.2.2 Construction of wxcB knockout and complemented strains in Xcv 34
• 2.2.3 Protein extraction and Peptide preparation 35
• 2.2.4 Mass spectrometry analysis 36
• 2.2.5 Protein/Peptide identification and quantification 37
• 2.2.6 Virulence assay 37
• 2.2.7 Biofilm assay 38
• 2.2.8 Motility assay 38
• 2.2.9 SDS tolerance assay 38
• 2.2.10 LPS analysis 39
• 2.2.11 Statistical analysis 39
• 2.3 Results and Discussions 40
• 3 References 59
• 4 국문초록 63