식품 중 비오틴 및 콜린의 기기분석법에 관한 연구 = Study on Instrumental Analysis of Biotin and Choline in Foods

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Biotin is a water-soluble vitamin belonging to the B-complex that acts as a coenzyme for certain enzymes, such as carboxylases, transcarboxylases and decarboxylases. These enzymes catalyze the incorporation, transfer or elimination, respectively, of a carboxyl group to (or, from) a biomolecule. It plays as a growth factor which performs important biochemical functions in body. When lack of biotin, it causes serious human disorders such as inherited syndrome, Multiple Carboxylase Deficiency (MCD). Biotin is wide spread in animal and plant foods. Liver and yeast are the best sources of biotin and egg yolk, beans, and cereals also contain fairly good amount. There are many biotin added market foods and medical supplies in these days. Meanwhile, choline is a kind of vitamin which is an essential component in foods of mammals. It is important as a component of lecithin molecule and is also essential for synthesis of acetylcholine relating delivery of nerve stimulus separated from the end of parasympathetic nerves. When lack of choline, the accumulation of fat in liver causes liver scleroma as well as other biochemical abnormalities. Therefore choline is added to foods and medical supplies. These exists in extremely small amounts in foods especially in milk therefore the analyzing methods used often have many defects affected by proteins and other substances. Here, by establishing the analyzing methods, it will contribute to effectiveness in prevention and curing of diseases as well as processing and quality control of health foods. The microbial method in Food Official Dictionary takes long time, shows high contamination of other microbes and the reproducibility is very low. In this study, the simple and cost efficient HPLC method is used to enhance the sensitivity of detection for analysis of small amount substances. By comparing the HPLC method and the conventional microbial testing method through this study, the present HPLC method appears to be valuable, giving fast, reliable and accurate data. It is very effective for detecting biotin and choline in foods. Accordingly, the HPLC method could be recorded in Food Official Dictionary.

국문 초록 (Abstract)

Biotin은 수용성으로 vitamin H로 알려져 있는 carboxyl기에 관여되는 각종 효소류에 대한 보조효소이며 생체내에서 매우 중요한 생화학적 기능을 수행하는 성장인자로서 이것이 결핍될 경우 multiple carboxylase deficiency 등 심각한 기능장애를 유발한다. biotin은 동, 식물성 식품에 널리 분포되어 있고, 간과 이스트 등이 가장 좋은 급원이며 난황, 콩, 곡식에도 상당량 함유되어 있다. 시판 식품이나 의약품에는 biotin이 첨가된 제품이 많은 실정이다. 한편 choline은 포유류의 음식물 중 필수성분으로 vitamin의 일종이다. 레시틴 분자의 구성성분으로도 중요하지만 부교감신경이 자극되어 그 말단부위에서 유리되는 신경자극의 전달과 밀접한 관련이 있는 아세틸콜린의 합성에도 필요하다. 이 물질은 결여되면 간에 지방침윤이 생기게 되는 지방성 간으로 섬유질 변화를 일으켜 간경화증과 관련이 있고 기타 여러 가지의 생화학적 이상현상을 일으키므로 역시 식품이나 의약품제제 중에 콜린을 첨가한다. 그런데 식품 중 특히 우유 등에 미량으로 존재하는 이들은 단백질이나 이종물질들의 영향으로 현재 이용되고 있는 분석법은 단점이 많아, 그 분석법을 확립하여 질병의 예방, 치료에 유효하고 이상적인 건강식품의 제조 및 품질관리에 기여하고자 한다. 현재 식품공전의 미생물 분석법은 시간적 손실이 많고 다른 미생물의 오염 및 재현성이 떨어지기 때문에 신속, 정확한 분석법의 개발이 요구되어지는바, 본 연구에서는 경제적이면서 간편하고 보편적으로 사용할 수 있는 HPLC를 이용하여 미량성분 분석을 위한 검출기의 감도를 높일 수 있는 유도체화 검출법을 이용하여 현 식품공전의 미생물학적 방법과 HPLC 분석법을 비교․검토함으로서 공전에 수재근거를 마련하고자 하였다.○ 연구목표 : 비오틴 및 콜린은 지방질과 아미노산의 형성과 작용에 관련된 기능을 하는 주요 비타민류 또는 그 전구체로서 비오틴 및 콜린의 결핍은 인체의 신진대사에 심각한 장애를 나타내기 때문에 영양보충식품이나 이유식 등에 영양강화 목적으로 첨가되고 있다. 현재 식품공전 중에 수록된 비오틴 및 콜린의 미생물 시험법은 시간적 손실이 많고 다른 미생물의 오염 및 현실성이 떨어지기 때문에 신속, 정확한 분석법의 개발이 요구된다. 따라서 경제적이면서 간편하고 보편적으로 사용할 수 있는 HPLC를 이용하여 미량성분 분석을 위한 검출기의 감도를 높일 수 있는 유도체화 검출법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 현 식품공전의 미생물학적 방법과 HPLC 분석법을 비교․검토함으로서 공전에 수재근거를 마련하고자 하며, 개발된 분석법을 이용하여 사전․후관리를 함으로서 식품위생의 정책자료로 활용하고자 하였다..
○ 연구내용 : 이유식용 유제품 중의 biotin 은 시료 10 g을 취하여 butanol 용액을 50 ㎖ 첨가하여 10분간 초음파 진탕기로 추출한 후 2800 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취하고 잔사는 다시 초음파 추출하는 과정을 3회 반복 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 후 여액을 농축하고 D.W. 5 ㎖을 첨가하여 10분간 70℃ 수욕상에서 가열한 후 hexane을 30 ㎖가하여 지방층을 제거하여 시험용액으로 사용하였다. 정제된 biotin은 K₂CO₃, 18-Crown-6 등의 존재 하에 Br-MDMC 와 50 ℃에서 유도체화한다. 이 유도체는 acetonitrile과 물의 혼합액을 이동상으로 하여 형광 detector를 이용한 HPLC 방법으로 검출하였다. 또한 biotin의 미생물 시험은 Lactobacillus plantarum를 접종균주로 하는 식품공전에 따라 일정시간 배양한 후 탁도측정에 의하여 정량하였다. 한편 choline은 시료 10 g을 취하여 methanol 용액을 50 ㎖ 첨가하여 70℃에서 30분간 수욕상에서 가열 추출한 후 2800 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고 잔사는 다시 가열 추출하는 과정을 3회 반복 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 후 여액을 농축시킨 후 acetonitrile 100 ㎖을 취하여 60℃에서 1시간 환류냉각 시킨 후 시험용액으로 사용하였다. 콜린 유도체 시약은 DBAP를 사용하며 이들콜린 유도체를 분석하기 위한 HPLC 분석조건은 column은 Capcellpak C18 Type MG (4.6×150 mm, 5 ㎛), mobile phase는 A : Acetonitrile, B : 0.02M KH₂PO₄, detector는 U.V (260 nm)를 사용하여 검출하였다. 또한 choline의 미생물학적인 시험법은 식품공전에 따라 Neurospora crassa를 접종균주로 하여 30 ℃에서 3일간 배양한 후, 건조균사체의 중량을 측정하고 얻어진 값에 환산계수 0.868을 곱하여 콜린의 함량을 구하며, HPLC 방법과 미생물학적인 방법으로 구한 각각의 측정치를 비교하였다.
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 연구의 결과는 현 식품공전의 미생물분석법과 대체함으로써 일선 식품위생검사 기관의 신속․정확한 검사업무에 활용가능하다. 우유, 유제품 등 건강식품 또는 건강보조식품 그리고 의약품 및 의약품제제 중의 biotin 및 choline의 미량정량이 가능하므로 식품이나 의약품제제 전반에 걸쳐 그 함량 분석에 기여할 수 있다. 앞으로 식품공전시험법으로 수재, 분석소요시간 단축 등으로 인한 경제적 이익 및 미량분석을 위한 과학적인 근거 자료로 활용 가능하며 식품위생의 정책자료로 활용이 기대된다. 기기분석법 중 보편적이고 정확한 HPLC 분석법을 확립함으로써 의약품 및 영양보충용식품등에 첨가되는 비오틴 및 콜린은 미량 성분이기 때문에 다른 성분에 의한 matrix 효과를 줄이면서 검출효율을 증가시킬 수 있는 방법을 확립한 것이라 할 수 있다.