산화된 DNA 변형염기의 검출을 위한 단클론 항체 개발 = Development of monoclonal antibodies for oxidized DNA bases

국문 초록 (Abstract)

DNA의 4개의 염기중 guanine은 산소프리라디칼의 공격에 의해 가장 쉽게 산화되는 염기이다. 8-Oxoguanine은 생체 내에서 가장 많이 생성되는 산화성 변형 염기들 중의 하나이며, 세포 DNA의 산화성 손상을 측정하는 수단으로서 많이 그 함량이 측정되어져 왔다 (Leipold, D. D. et al., 2000). 8-Oxoguanine은 C 대신 A와 mismatch하는 확률이 높아 GC → TA 돌연변이를 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나 8-Oxoguanine은 그 모태인 guanine보다 반응성이 훨씬 높아 산소프리라디칼에 의해 산화반응이 더 잘 유발되어 다양한 다른 변형물질을 생성하는 것으로 고되었다. (Duarte, V. et al, 2001). 이것은 세포의 산화성 손상 시에 8-Oxoguanine이 중간 생성물이며 최종적으로는 더 산화된 변형염기가 생성됨을 의미한다. 따라서 DNA 손상의 정확한 평가와 정량에는 8-Oxoguanine으로부터 유래된 산화성 손상 염기를 측정하는 기술이 필요하다. 이에 본 연구에서는 8-Oxoguanine으로부터 유래된 산화성 손상 염기를 검출할 수 있는 단클론 항체를 개발하기 위하여 먼저 광민감제인 methylene blue 존재 하에서 8-Oxoguanine을 광산화시켜 그 생성물들의 구조를 확인하고, 그 중 oxaluric aicd nucleoside를 분리하여 소 혈청 단백질에 결합시킨 것을 항원으로 사용하여 생쥐로부터 단클론 항체를 생성하였다. DNA의 deoxyribonuceloside가 아닌 8-Oxoguanine의 ribonucleoside인 8-Oxoguanine을 사용한 이유는 nucleoside는 분자량이 항원으로 작용할 만큼 크지 않으므로 단백질(소 혈청 단백질)에 결합시킨 복합체를 항원으로 사용하기 위함이다. 변형된 염기를 특이적으로 인지하는 항원을 생성시키기 위해 ribose의 두 개의 hydroxyl기를 periodate 반응에 의해 산화시켜 단백질의 lysine 잔기에 결합시켜 변형된 염기를 항체 생성계에 노출시키는 방법을 사용하였다.
산소라디칼은 세포생물학적 수준의 기초연구에서부터 발암유발기전, 항산화제 개발, 공해, 산업의학, 약물독성 및 항암제 개발 등의 응용연구에 이르기까지 생명공학의 모든 분야에서 주요 연구대상이 되고 있다. 이 같은 연구에서 가장 절실히 요구되는 것은 산소프리라디칼의 유해작용 판정이며 DNA 손상판정법은 분자생물학을 바탕으로 하고 있다는 점에서 그 유용성이 매우 크다 할 수 있다.
본 연구에서 개발된 oxaluric acid 특이적 단클론 항체는 인체에 대한 산화적 DNA손상을 혈액, 뇨, 강액, 뇌척수액, 자궁양수액 등의 체액의 변형 DNA 염기를 측정하여 인체에 대한 DNA 손상을 판정하고, 면역조직화학적인 응용을 통하여 조직특이적인 DNA 손상을 판정하는 등의 다양한 응용범위에 활용될 수 있다. 뿐만 아니라 손상 DNA의 수선에 관련된 단백질들의 확인 등 연구목적으로도 사용될 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Oxidative reactions within DNA commonly result in base modifications. Among them, 8-oxoguanine has been extensively studied in terms of repair and mutagenecity. However, 8-oxoguanine is highly susceptable to further oxidation. We photooxidized 8-oxoguanosine in the presence of a photosensitizer, methylene blue. The reaction products were separated by HPLC, and the main produce were characterized by LC/ESI/MS and LC/ESI/MS/MS. The main products were identified as spiroiminodihydantoin (Sp), iminoallantoin (Ia), and oxaluric acid nucelosides. The formation of the oxaluric acid was accounted for by a type Ⅱ mechanism involving formation of singlet oxygen, and the formation of Sp and Ia was by a type Ⅰ mechanism involving one electron oxidation. As an effort to develop an immunological assay which allows evaluation of the oxidized DNA lesions, we produced monoclonal antibodies by using isolated oxidized nucleosides conjugated to bovine serum albumin as antigens. The conjugates were prepared in the war that oxidized bases were exposed by linking ribose ring an the nucleosides to the protein.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약 = ⅰ
• 목차 = ⅲ
• 표목차 = ⅳ
• 그림목차 = ⅴ
• Ⅰ. 배경 = 1
• 1. 서론 = 1
• 2. 참고문헌 = 4
• Ⅱ. 8-Oxoguanosine의 광산화 반응 생성물의 분리 및 확인 = 6
• 1. 국문요약 = 7
• 2. 서론 = 8
• 3. 실험 기구 및 방법 = 11
• 3.1. 시약 = 11
• 3.2. 기구 = 12
• 3.3. 실험방법 = 13
• 4. 실험결과 = 16
• 5. 고찰 = 19
• 6. 참고문헌 = 21
• Ⅲ. 8-Oxoguanine의 산화물인 oxaluric acid를 인지하는 단클론 항체 제작 = 35
• 1. 국문요약 = 36
• 2. 서론 = 37
• 3. 실험 기구 및 방법 = 38
• 3.1. 시약 = 38
• 3.2. 기구 = 40
• 3.3. 실험방법 = 41
• 4. 실험결과 = 46
• 5. 고찰 = 48
• 6. 참고문헌 = 51
• Abstract = 63