스트레스에 의한 기억 장애에 있어서 편도체와 해마의 상호작용에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

1) 내용
■ 기저외측 편도체neuron의 특이적 손상이 스트레스 전, 후의 혈중 스트레스 호르몬인 corticosterone과 해마에서의 GR과 ERK의 인산화에 미치는 영향을 알아봄으로써 선행 연구(많은 행동지표)의 결과와 상관성을 확인하고자 함

▷ 신경독소(NMDA)를 사용하여 기저외측 편도체 neuron의 사멸 유도

▷ PTSD동물모델을 사용하여 스트레스 유발
; Restraint tail-shock stress model (인간에게서 보여지는 스트레스로 인한 인지장애 및 우울증 유사 효과를 유발하는 동물모델)

▷ 스트레스 직후 및 1시간 경과후의 스트레스 관련 호르몬변화 및 해마의 GR과 pERK발현의 변화 양상 비교


2) 방법
■ 기저외측 편도체 손상
- 실험동물로 male Sprague Dawley rats을 사용
- 네 개의 군으로 분류 (shame-control, shame-stress, lesion-control, lesion-stress)
- 실험동물을 isoflurane으로 마취한 후 Stereotaxic instrument에서 ear bar로 두부를 고정, 절개
- 뇌의 bregma로부터 -2.8 mm posterior, ±5.0 mm lateral, -8.4 / -8.7 mm ventral 위치, 즉 기저 외측 편도체 (Basolateral amygdala, BLA)에 cannula를 사용하여 신경독소 주입
; shame-control/stress군은 phosphate buffered saline(PBS)을, BLA lesion군 (lesion-control/stress 군)은 12.5 ug/ul농도의 NMDA(N-methyl D-aspartate )를 총 0.6 ul 를 주입
- 수술 후 2 주간의 회복기간을 가짐.

■ 스트레스 유발
- 구금과 꼬리 전기 쇼크에 의한 스트레스 유발
; stress군의 실험동물을 구금하여 60 분간 꼬리에 전기 쇼크 (30~90초 간격으로 1초간, 1 mA의 예측 불가능한 전기 쇼크 60회)을 줌

■ 조직 염색을 통한 편도체 손상 확인
- 전기 쇼크 후 구금없이 자유로운 상태에서 1시간 둔 다음 희생시켜 amygdala 부위는 포르말린 고정액에 넣고 해마는 따로 냉동 보관
- 포르말린 용액에 고정 후 30% sucrose solution에 넣어 조직이 가라앉으면 드라이아이스로 얼림
- microtome 으로 section제작
- Thionin stain(neuron 염색)과 gold chloride myelin stain(fiber 염색)

■ Corticosterone 측정
- 스트레스 시 증가되는 호르몬인 corticosterone의 변화 양상을 확인
; 스트레스 전과 후 꼬리정맥에서 채혈하여 혈장을 분리, 효소 면역법 (enzyme immunoassay) 사용하여 측정

■ 해마의 GR(Glucocorticoid Receptor)과 MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase) 발현 비교
- 해마를 Murphy EK (2002, Endocrinology) 방법에 따라 세포질과 핵 분획을 얻음
- 단백질은 Bradford 법으로 정량한 후 전기영동 후 membrane transfer하여 western blot 을 함
; GR과 MAPK(p ERK/ ERK)

■ 면역조직화학적 염색을 통한 해마 pERK의 발현 조사
- microtome으로 section한 floating tissues을 p44/42 MAPK 항체를 사용하여 avidin-biotin–peroxidase complex (ABC) method로 염색
- western blot의 결과와 비교

3) 범위
■ 선행연구에서 편도체 손상시킨 실험동물에 스트레스를 가한 직후 일부 연구결과를 얻었으며 이 프로토콜을 반복시행하여pERK의 해마에서의 발현을 면역조직염색으로 재확인

■ 다른 선행연구인 수중 미로 및 공포조건화 등 많은 행동지표와 스트레스 후 동일 시간 경과 후에 희생시켜 corticosterone 및 western blot과 면역조직염색하여 결과를 종합

■ 또한 스트레스 직후의 결과와 비교하여 선행연구와 현 연구결과를 통합하여 스트레스 경과 시간에 따른 결과 도출