한약재의 생리활성성분 분리 및 분석연구(시호, 방풍) = Study on the isolation and analysis of biologically active components from Bupleuri Radix and Saposhnikoviae Radix

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 시호, 방풍에 대한 체계적이고 과학적인 성분 분리 및 분석법을 확립하고 이를 검증하기 위해 시호, 방풍의 지표물질의 분리법 확립 및 대량 분리, 시호, 방풍의 미량 함유 물질 중 지표물질에 준할 수 있는 물질 선별 및 분리, 시호 및 방풍의 분석용 표준품의 제조 및 제출, TLC, HPLC-UV, LC-MS/MS 분석법을 이용하여 시호, 방풍의 생리활성성분 동시분석법을 개발하고 분석법검증(validation)을 실시하며, 이를 기반으로 패턴인식 또는 지문인식법에 따른 기원별, 산지별 한약재정보 구축을 목표로 한다. 방풍의 EtOAc분획에서 21종의 화합물(3’O-angeloylhamaudol, β-sitosterol, marmesin, phellopterin, anomalin, imperatorin, xanthotoxin, deltoin, bergapten, stigmasterol, ledebouriellol, hamaudol, 8’-epicleomioscin, xanthoarnol, cimifugin, 5-O-methylvisamminol, daucosterol, 4’-O-glucosyl-5-O-methylvisamminol, nodakenin, sec-O-glucosylhamaudol, prim-O-glucosylcimifugin)을, 시호의 n-BuOH 분획물을 대상으로 하여 12종의 물질(saikosaponin D, saikosaponin C, saikosaponin B₄, saikosaponin B₂, saikosaponin B₃, saikosaponin A, saikosaponin H, saikosaponin I, saikosaponin B₁ , saikosaponin G와 미지시료 crystal, 5-1, 5-2. 현재 구조분석중)을 분리하였다. 방풍의 지표성분으로는 imperatorin, phellopterin, 3'-O-angeloylhamaudol을, 시호의 지표성분으로는 saikosaponin A, saikosaponin C, saikosaponin D를 선정하였다. 시호 및 방풍의 생리활성성분에 대한 TLC, HPLC-ELSD 및 LC-MS의 동시분석법을 개발하였다. 시호의 HPLC-ELSD 동시 분석법 및 방풍의 HPLC-UV 동시 분석법에 대한 분석법 검증 (analytical method validation)이 실시되었으며 그 결과, 각 성분에 대하여 넓은 농도 범위 내에서 양호한 직선성, 정밀성, 정확성과 낮은 정량한계를 갖고 있음을 확인하였다. 또한 분석조건을 고의로 변동시켰을 때의 분석법의 신뢰성을 평가하기 위하여 완건성 실험을 수행하였다. 칼럼 온도, 유속, 이동상 조성 기울기, 칼럼을 변화시켜가며 area precision (C.V.), relative retention time (RRT), theoretical plate number (N) 그리고 tailing factor (T)를 비교하여 평가한 결과 대부분의 조건에서 분석법이 완건함을 확인하였다. 시호 및 방풍 한약재에서 각 한약재의 주 생리활성성분을 추출하는 추출법을 최적화하였다. 시중에서 구입하거나 제 1세부 기관으로부터 제공 받은 시호 20종, 방풍 24종의 한약재를 추출하여 확립한 시호의 HPLC-ELSD 및 방풍의 HPLC-UV법에 적용하여 함량분석을 하였다. 함량분석의 결과를 근거로 하여 군집 분석 (Cluster analysis) 및 주성분 분석 (Principal Component Analysis)을 실시하였다. 시호의 생리활성 성분에 대한 LC-MS 동시분석법을 개발하였으며 MRM mode와 SIM mode를 비교한 결과 감도가 더 좋은 SIM mode로 분석하였다. 방풍의 생리활성성분 LC-MS/MS 동시분석은 선택성이 높은 MRM mode로 실시되었다. 각 LC-MS/MS분석법에 대하여 분석법 검증을 실시한 결과 넓은 농도 범위 내에서 양호한 직선성, 정밀성, 정확성과 낮을 정량한계를 갖고 있음을 확인하였다.○ 연구목표
한약재 과학화 사업 중의 시호, 방풍에 대한 체계적이고 과학적인 성분 분리 및 분석법을 확립하고 이를 검증하는 것을 그 최종 목표로 한다. 이를 위해서 다음과 같은 구체적인 목표를 제시하는 바이다.
- 시호, 방풍의 지표물질의 분리법 확립 및 대량 분리
- 시호, 방풍의 미량 함유 물질 중 지표물질에 준할 수 있는 물질 선별 및 분리
- 시호 및 방풍의 분석용 표준품의 제조 및 제출
각종 크로마토그래피법을 이용하여 다양한 성분을 시호, 방풍으로부터 분리해내며 이를 대량분리한다. 또한 분리된 여러 성분중에서 지표물질을 선별하고 지표물질에 준할 수 있는 물질을 선별하는 것을 목표로 한다. 또한 TLC, HPLC-UV, LC-MS/MS 분석법을 이용하여 시호, 방풍의 생리활성성분 동시분석법을 개발하고 분석법 검증(validation)을 실시하며, 이를 기반으로 패턴인식 또는 지문인식법에 따른 기원별, 산지별 한약재 정보 구축을 목표로 한다.
○ 연구내용
1차로 건조된 방풍 5Kg을 세절하여 MeOH로 90분씩 3회 초음파 추출하여 이를 감압 건조하여 715.5g의 추출물을 얻었다. 이를 다시 증류수에 현탁하여 차례로 EtOAc로 분획하여 EtOAc분획(196.7g)의 분획물을 얻었다. EtOAc분획에 대하여 다양한 컬럼 크로마토그래피 기법을 이용하여 6종의 화합물을, 2차로 방풍 10Kg을 세절하여 MeOH로 90분씩 3회 초음파 추출하여 이를 감압 건조하여 1315.5g의 추출물을 얻었다. 이를 다시 증류수에 현탁하여 EtOAc로 분획하고 얻은 분획물을 감압농축하여 EtOAc분획 (397.5g)의 분획물을 얻었다. 이 분획에 대해 마찬가지로 다양한 컬럼크로마토그래피법을 이용하여 15종의 화합물을 얻었다.
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다국어 초록 (Multilingual Abstract)

his study aimed to set up the method of isolation and analysis of the Bupleuri Radix and Saposhnikoviae Radix. For this purpose, we isolated the active components from these herbal medicines and selected major active compounds. The method of simultaneous analysis was developed and validated. At this basis, the information (its origin and growing district)of these herbal medicines was achieved by pattern analysis and fingerprinting recognition. We isolated 21 compounds from the EtOAc fraction of methanolic Saposhnikoviae Radix (3’-O-angeloylhamaudol, β-sitosterol, marmesin, phellopterin, anomalin, imperatorin, xanthotoxin, deltoin, bergapten, stigmasterol, ledebouriellol, hamaudol, 8’-epicleomioscin, xanthoarnol, cimifugin, 5-O-methylvisamminol, daucosterol, 4’-O-glucosyl-5-O-methylvisamminol, nodakenin, sec-O-glucosylhamaudol, prim-O-glucosylcimifugin) and 10 saikosaponins (saikosaponin D, saikosaponin C, saikosaponin B₄, saikosaponin B₂, saikosaponin B₃, saikosaponin A, saikosaponin H, saikosaponin I, saikosaponin B₁, saikosaponin G) from the n-BuOH fraction of 80% methanolic extract of Bupleuri Radix. Among these compounds, imperatorin, phellopterin, 3'-O-angeloylhamaudol were selected as the major active compounds of Saposhnikoviae Radix, saikosaponin A, saikosaponin C, saikosaponin D were selected as the major active compounds of Bupleuri Radix. The methods of simultaneous analysis using TLC, HPLC-ELSD and LC-MS were developed. HPLC-ELSD analysis method of Bupleuri Radix and HPLC-UV analysis methods of Saposhnikoviae Radix were validated. The validation was performed at the points of linearity, precision, accuracy, robustness. In robustness test, area precision (C.V.), relative retention time (RRT), theoretical plate number (N), and tailing factor (T) were evaluated while changed the column temperature, flow rate, mobile phase composition, column. And the extraction methods of Bupleuri Radix and Saposhnikoviae Radix were optimized. 20 Bupleuri Radix samples and 24 Saposhnikoviae Radix samples were extracted by optimized extraction methods. These extracts were analysed by composition analysis method. This results were performed by Cluster analysis and Principal Component Analysis. LC-MS simultaeneous analysis of the active components of Bupleuri were developed using SIM mode and LC-MS/MS analysis of the components of Saposhnikoviae Radix were developed using MRM mode.