Mass Spectrometry-based Glycomic Studies for Gastric Cancer Biomarker Discovery|RISS 상세보기

국문 초록 (Abstract)

당쇄화 (glycosylation)는 가장 대표적인 번역 후 변형 (post-translational modification, PTM) 중 하나이며 단백질 기능 및 세포-세포 상호작용과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중추적인 역할을 하고 있다. 또한 당쇄화의 결과물인 당사슬 (glycans) 은 생체 내 환경의 변화에 매우 민감하기 때문에 암 및 감염성 질환 등 다양한 질병에서 바이오마커의 원천으로써 큰 잠재력을 지니고 있다. 특히, 혈관신생, 세포-세포 유착, 종양 전이를 포함한 암의 진행은 다양한 암에서 글리코실화와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
질량분석은 단백질체학 (proteomics)에서 당쇄체학 (glycomics) 에 이르기까지 다양한 오믹스에서 사용되는 강력한 기술이다. 최근 당쇄화의 분석은 고감도 및 고분해능 질량분석기술을 기반으로 진행되고 있다. 액체크로마토그래피 (Liquid chromatography, LC) 와 결합된 질량분석기 (mass spectrometry, MS) 는 당사슬의 정성 및 정량, 구조의 규명을 가능하게 하므로 다양한 당쇄화의 분석에서 활발하게 활용되고 있다. 특히 당사슬 기반의 바이오마커 분야에서의 질량분석기술의 도입은 연구를 가속화 하였다.
현재 질량분석 기반의 질병 진단, 특히 암 바이오마커의 연구는 전 세계적으로 많은 연구팀과 대형 병원 등에서 활발하게 이루어지고 있다. 그러나 대용량의 임상 시료 전처리나 빠른 진단을 위한 신속한 분석 및 좀 더 쉬운 데이터 해석 등 실제 진단으로의 적용을 위해서는 아직 해결해야 할 부분이 많다. 본 연구에서는 대용량의 임상 시료 전처리 및 이를 기반으로 한 혈액 내 당사슬 및 당단백질 분석을 통한 암 바이오마커의 발굴과 함께 표적 당단백질의 당쇄화를 이용한 바이오마커 발굴 및 진단의 민감도와 특이도를 높이며 빠르고 쉬운 데이터 해석을 가능하게 할 수 있는 새로운 중간-상하향 접근법을 제시하고자 한다. 본 학위논문은 게재된 논문 3편을 포함하여 총 4개의 Chapter로 구성되었다.
Chapter 1의 ‘Introduction to mass spectrometry-based gastric cancer biomarkers studies using glycosylation’는 연구 내용에 앞서 위암 진단 관련 기반 지식 제공 및 본 연구에 대한 필요성의 강조를 위하여 작성되었다. 현재 임상에서 사용되고 있는 위암 진단 방법인 위 내시경, upper gastrointestinal series에 대하여 소개하며, 혈액 내 농도 측정을 기반으로 하는 분자 바이오마커에 대하여 서술하였다. 또한 위암을 포함한 질량분석기반의 암 바이오마커 발굴에 대해서도 간략히 소개한다.
Chapter 2 의 ‘Glycomic profiling of targeted serum haptoglobin for gastric cancer using nano LC/MS and LC/MS/MS’는 Molecular Biosystems, 2016, 12(12)과 “Direct analysis of aberrant glycosylation on haptoglobin in patients with gastric cancer”, Oncotarget, 2016, 10.18632/oncotarget.14362 에 게재된 논문의 내용을 기반으로 구성되어 있으며 혈액 내 당단백질인 합토글로빈의 N-당사슬을 질량분석을 이용하여 위암 진단으로의 활용 가능성을 확인하고 잠재적인 바이오마커를 발굴한 연구이다. 합토글로빈 단백질은 면역친화컬럼(immuno-affinity column)을 통하여 혈청시료에서 분리, 정제되었다. N-glycan을 기반으로 한 분석에서는 다양한 당사슬 중 tri-, tetra-antennary 구조를 가지는 fucose가 붙은 N-glycan들이 위암 환자에서 증가하였으며, 탄뎀 질량분석을 통한 이들의 구조 확인에서 주로 말단의 HexNAc에 fucose가 붙는sialyl-Lea 또는 sialyl-Lex구조임을 확인할 수 있었다. 온전한 당 단백질 분석 (intact haptoglobin) 에서는 합토글로빈은 당사슬 효소처리와 분리, 정제 과정 없이 단백질 변성만을 거친 후 질량분석이 진행되었다. 합토글로빈의 질량분석 피크를 기준으로 강도 (intensity)와 마커가 정의되었다. 강도 마커에서는 AUC > 0.8인 6개의 마커가 발견되었으며 가장 높은 효율의 마커는 0.93의 AUC를 나타내었다.
Chapter 3의 ‘Detection of aberrant glycosylation of serum haptoglobin for gastric cancer diagnosis using middle-up-down glycoproteome platform’은 Journal of Personalized Medicine, 2021, 11(6), 575. 에 게재된 논문을 기반으로 구성되어 있으며 앞서 진행한 3종의 연구 결과를 바탕으로 실제 임상 진단에 보다 더 적합한 새로운 중간-상하향 분석 플랫폼을 제시한 논문이다. 합토글로빈 시료는 가장 많이 사용되는 단백질 분해효소인 트립신 (trypsin) 으로 처리되었으며 일반적으로 펩타이드 분석에 적용하는 탄뎀 질량분석 (tandem MS) 이 아닌 단순한 single MS 분석만이 진행되었다. 전처리과정의 간소화를 위하여 당펩타이드는 추가적인 분리정제 없이 LC상에서 C4 가드 컬럼으로 농축되었으며 디페닐컬럼을 연결한 액체크로마토그래피-질량분석기로 분석되었다. 정상인과 위암 환자를 합하여 총 80개의 임상 시료가 분석되었으며 트립신에 의해 생성된 3종의 당펩타이드에 대하여 바이오마커 발굴을 위한 비교를 진행하였다. 당펩타이드는 in-silico library에 의해 복잡한 탄뎀 질량분석 결과의 해석 없이 쉽고 빠르게 동정되었으며 AUC (0.783-0.901)를 나타내는 고감도 고특이성 당펩타이드 위암 바이오마커를 발굴할 수 있었으며 이들을 기반으로 도출한 결합 바이오마커 3종은 각각 0.950, 0.929, 0.977의 높은 AUC를 나타내었다. 본 접근법은 합토글로빈과 위암에 국한되지 않고 당단백질을 이용한 다양한 질병 진단에 적용 가능한 플랫폼으로 널리 활용 될 수 있으리라 기대된다.
Chapter 4의 ‘Automated glycan sample preparation system for clinical biomarker discovery’는 임상 진단을 위한 대용량의 혈청 시료의 당사슬 분리 정제 전처리 과정을 자동화 하는 과정과 실험 재현성 (reproducibility) 도출을 통한 실제 진단에의 활용 가능성에 대하여 기술하였다. 정상인과 난소암 환자의 혈청 시료 및 상업적으로 구매 가능한 표준품 혈청을 포함하여 총 480개의 시료가 24개의 well, 20배치로 구성되어 liquid handling system을 이용하여 한번에 고체상 추출법을 통하여 전처리 되었으며 이후 MALDI-TOF질량분석기를 통하여 당사슬 프로파일링을 진행하였다. 동일한 표준품 시료의 결과를 바탕으로 동일 배치 내 CV 0.2이하, 시료 간 R=0.95-0.99의 높은 재현성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 배치 간 재현성 또한 4개의 배치에서 당사슬이 존재하는 강도 영역대에서 좋은 직선성을 보였다. 96-well 시스템은 고체상 추출단계뿐만 아니라 단백질 변성과정까지 자동화 할 수 있었으며 시료의 수가 더 많아졌음에도 불구하고 상관계수 0.96 – 1의 높은 재현성을 나타내였다.

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당쇄화 (glycosylation)는 가장 대표적인 번역 후 변형 (post-translational modification, PTM) 중 하나이며 단백질 기능 및 세포-세포 상호작용과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중추적인 역할을 하고 있...

목차 (Table of Contents)

Overview 1
I. Introduction to MS-based Gastric Cancer Biomarker Studies using Glycosylation 6
1. Introduction 7
2. Protein glycosylation 10
3. Mass spectrometry 14

Overview 1
I. Introduction to MS-based Gastric Cancer Biomarker Studies using Glycosylation 6
1. Introduction 7
2. Protein glycosylation 10
3. Mass spectrometry 14
4. Current methods of diagnosing stomach cancer 16
5. Gastric cancer Biomarker Discovery on MS-based Glycosylation Analysis 20
6. Conclusions 23
7. References 24
II. Haptoglobin glycosylation and gastric cancer biomarker discovery 35
1. Introduction 36
2. Materials and Methods 39
A. Materials and reagents 39
B. Serum samples from gastric cancer patients and healthy control subjects 39
C. Haptoglobin purification from serum samples 43
D. Enzymatic release and enrichment of N-glycan by solid-phase extraction 43
E. Denaturation and alkylation of haptoglobin for intact glycoprotein analysis 44
F. Chip-based nano-LC/MS and MS/MS analysis 45
G. Intact haptoglobin Analysis 46
H. N-glycan identification and data processing 47
I. Statistical analysis of intact haptoglobin 47
3. Results and Discussion 49
A. LC/MS-based N-glycan profiling of serum haptoglobin 51
B. Glycan changes of haptoglobin in patients with gastric cancer 57
C. Characteristic structural features of haptoglobin N-glycans 61
D. N-glycan signatures of haptoglobin in gastric cancer: biosynthetic approach 65
E. Mass spectrometric monitoring of intact haptoglobin 70
F. Discovery of screening makers for gastric cancer 73
4. Conclusions 77
5. References 79
III. Detection of aberrant glycosylation of serum haptoglobin for gastric cancer diagnosis using middle-up-down glycoproteome platform 91
1. Introduction 92
2. Materials and Methods 97
A. Materials and reagents 97
B. Serum samples from gastric cancer patients and healthy control subjects 97
C. Haptoglobin purification from serum samples 100
D. Enzymatic digestion for glycopeptide production 100
E. LC-MS analysis of haptoglobin glycopeptide 101
F. Data processing, glycopeptide identification, and statistical analysis 102
3. Results and Discussion 103
A. Analytical strategy using a middle-up-down glycoproteome approach 103
B. Identification of glycopeptides using in-silico haptoglobin glycopeptide library 107
C. Gastric cancer biomarker discovery via middle-up-down glycoproteome platform 114
4. Conclusions 123
5. Supporting Information 125
6. References 144
IV. Automated glycan sample preparation system for clinical biomarker discovery 156
1. Introduction 157
2. Materials and Methods 160
A. Materials and reagents 160
B. Enzymatic release of N-glycan 160
C. Glycan purification by automated solid-phase extraction 161
D. MALDI-TOF MS analysis 162
3. Results and Discussion 163
A. Workflow of automated solid-phase extraction system 163
B. Reproducibility of automated SPE system 168
4. Conclusions 173
5. References 174
General Conclusion 176
국문 초록 179

참고문헌 (Reference)

1. Exploring life 's sweet spot, Seeberger , P. H., 437 ( 7063 ) , 1239, , 2005

2. Glycomics hits the big time ., Hart , G. W. ; Copeland , R. J. ,, 143 ( 5 ) , 672-6 ., , 2010

3. Glycosylation and metastases ., Josic , D. ; Martinovic , T. ; Pavelic , K. ,, 40 ( 1 ) , 140-150 ., , 2019

4. Mass spectrometry and glycomics, Zaia , J. ,, 14 ( 4 ) , 401-18 ., , 2010

5. Protein glycosylation in cancer, Stowell , S. R. ; Ju , T. ; Cummings , R. D., 10 , 473-510 ., , 2015

6. Glycomics using mass spectrometry, Wuhrer , M., 30 ( 1 ) , 11-22 ., , 2013

7. A brief history of mass spectrometry, Griffiths , J., 80 ( 15 ) , 5678-83 ., , 2008

8. Pain free versus painful gastroscopy ], Lagercrantz , B., 113 ., , 2016

9. Fucosylation and gastrointestinal cancer, Moriwaki , K. ; Miyoshi , E. ,, 2 ( 4 ) , 151-61 ., , 2010

10. Glycoscience aids in biomarker discovery, Hua , S. ; An , H. J., 45 ( 6 ) , 323-30 ., , 2012