세균성 키토산 가수분해효소의 부분적 특성 = Some characteristics of a chitosan-depolymerizing enzyme from an unidentified bacterium

국문 초록 (Abstract)

chitosan은 D-glucosamine이 β-(1→4) 결합으로 중합된 homopolymer로 chitin을 탈아세틸화(deacetylation)하여 제조된다. chitin은 갑각류의 껍질이나 곤충의 외피, 사상균체의 세포벽을 구성하고 있다. chitin, chitosan 또는 그 분해산물이나 유도체들의 산업적 효율성이 밝혀지면서, 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 중의 한 분야가 효소 분해법을 이용한 chitosan oligomer(chitosanoligosaccharides)의 생산이다. 본 연구에서는 chitosan을 분해하는 미동정 세균의 배양액으로부터 chitosan 가수분해효소(chitosanase)를 분리·정제하여, 주요 특성을 조사하였다. 세균의 무세포 배양액을 한외여과기(NMWL, 1K)로 여과하여 저분자량의 화합물을 제거한 다음 황산암모늄을 가하여 90% 포화시키고, 침전된 단백질을 회수하여 gel permeation chromatography(sephadex G-10과 G-100)로 chitosanase를 정제하였다. 정제전 효소의 비활성은 5.8U/mg 이었으나 정제과정을 통하여 9.7U/mg으로 증대되었다. 정제 전후를 통하여 SDS-PAGE 법에 의한 단백질의 분석과 효소활성 염색으로 한 종류의 chitosanase가 확인되었으며, 그 분자량은 약 30,000dalton 이었고, subunit는 한 종류인 것으로 추정되었다. chitosanase에 의한 기질의 분해산물을 한외여과와 TLC로 분석한 결과, 이 효소는 이량체에서 육량체까지의 chitosanoligosaccharides를 생산하였으며, 단량체를 생산하지 않는 특징이 있었다. 효소반응 최적온도는 40℃이었고, 50℃ 이상에서는 효소의 활성이 급격히 저하되어, 비교적 열안전성이 낮았다. 또한, 이 효소는 pH 5.0∼9.0 범위에서 1시간 방치해도 활성변화가 미미하여, 비교적 광범위한 중성영역에서 안정하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chitosan is a polymer of D-glucosamine linked by β-(1→4) covalent bonds. It is obtained through deacetylation of chitin that occurs mainly in the shells of crustaceans and the exoskeletons of insects. It is also found in fungal cell walls. Having relatively rich natural resources, chitin and their derivatives are widely utilized in industries. Among those are chitosanoligosaccharides that are reported to have several biological functions. The production of chitosanoligosaccharides requires hydrolysis of chitosan by an acid or an enzyme. A chitosanase, the chitosan-depolymerizing enzyme, was purified from unidentified bacterial culture and its characteristics were determined. Cell-free culture of the unidentified bacterium was filtered with ultramembrane(NMWL, 1K) to remove low molecular weight compounds. Ammonium sulfate was added to the filtrate at the level of 90% saturation to induce precipitation of proteins. The precipitated proteins were desalted with sephadex G-10 column and fractionated through sephadex G-100 gel permeation chromatography. Specific activity of the enzyme before purification was 5.8 units/mg and was increased up to 9.7 units/mg through purification procedures. SDS-PAGE analysis of proteins and enzyme activity staining revealed only one kind of chitosanase in the bacterial culture. Its molecular weight was about 30,000 dalton with one kind of subunit. The catalytic unit could highly be a monomeric protein. TLC-analysis of enzymatic hydrolysis products of chitosan showed that the enzyme generated dimeric through hexameric oligomers of D-glucosamine without producing monomeric D-glucosamine. Its optimum temperature for catalytic activity was 40℃ and the catalytic activity dropped rapidly at the temperatures higher than 50℃, which reflected its low heat stability. The enzyme was stable for at least one hour at neutral pH ranges from 5.0∼9.0.